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流式實(shí)驗(yàn)中為什么要用同型對(duì)照，如何選擇同型對(duì)照？
點(diǎn)擊次數(shù)：2161 發(fā)布時(shí)間：2014-12-2
流式實(shí)驗(yàn)中為什么要用同型對(duì)照，如何選擇同型對(duì)照？
一、
為什么要用同型對(duì)照？
同 型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型 對(duì)照是真正意思上的陰性對(duì)照，它不但可以用來設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。
在流式細(xì)胞儀上樣前，染色方式如下：樣本管：一抗＋樣本，同型對(duì)照管：同型對(duì)照＋樣本
二、如何選擇同型對(duì)照？
(1)一般選擇與一抗的成分*相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比如抗人的CD56 FITC標(biāo)記的抗體，成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是FITC標(biāo)記的MouseIgG1,κ。注意同型對(duì)照的成份跟它的名稱是相同的.
(2)如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照。比如CD86的純化抗體，成分是MouseIgG1,κ。它的同 型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下：樣本管：純化的CD86＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本,同型對(duì)照管：純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗MouseIgG1(二抗 )＋樣本.
(3)如果沒有找到適合的同型對(duì)照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同--亞型不同--相同類 別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里面找到不到*相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記Mouse IgG2а為同型對(duì)照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照。如果zui后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。
3、哪些客戶需要使用同型對(duì)照？
A 對(duì)流式不是非常熟悉的客戶。
B 做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。
C 使用不常見的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的客戶，因?yàn)榭蛻舨皇煜げ怀Ｒ姌?biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽性。
D 對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的客戶，一般可以不使用同型對(duì)照。
4、為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？
首先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。