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技術(shù)文章
學(xué)習(xí)凋亡試劑盒的檢測步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：1467 發(fā)布時(shí)間：2015-12-21
實(shí)驗(yàn)方法
該實(shí)驗(yàn)采用的是經(jīng)過優(yōu)化的喜樹堿誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞系凋亡實(shí)驗(yàn)條件。其他類型的細(xì)胞需做相應(yīng)調(diào)整。
該試劑盒在傳統(tǒng)及Attune?聲波聚焦流式細(xì)胞儀上驗(yàn)證過，使用Attune?聲波聚焦流式細(xì)胞儀時(shí)，各種流速（25 μL/min 到 1,000 μL/min）都可以。
1.用有效方法誘導(dǎo)凋亡；設(shè)一不加誘導(dǎo)的陰性對照。
2.孵育之后收集細(xì)胞并用冷的PBS洗滌。
3.制備1×annexin V 結(jié)合緩沖液：按10次分析的量計(jì)算，加1 mL試劑C到4ml的去離子水中。
4.制備100μg/mL的PI工作液：用45μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液稀釋5μl試劑B，剩余可保存?zhèn)溆谩?/div>
5.再次離心步驟2中收集的細(xì)胞，棄去上清，重懸在1×annexinV 結(jié)合緩沖液。計(jì)數(shù)并用上述緩沖液稀釋至約1 × 106 cells/mL。按每次實(shí)驗(yàn)用量100μl準(zhǔn)備充分。
6.在每100μl細(xì)胞懸液中加入5μl試劑A和1μl步驟4制備的PI工作液。
7. 室溫孵育15min。
8. 孵育結(jié)束，加400μl 1×annexin V 結(jié)合緩沖液，輕輕混勻后置于冰上。
9.盡快對染色細(xì)胞進(jìn)行分析?？捎肍L1檢測530nm激發(fā)光，F(xiàn)L3檢測>575nm的激發(fā)光。細(xì)胞群將被分為三組：活細(xì)胞顯示弱熒光，凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光，而死細(xì)胞則同時(shí)發(fā)紅、綠熒光。
10. 可用熒光顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果，適用檢測FITC、TRITC或Texas Red?的濾光片檢測。
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