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細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

時間:2019/3/27閱讀:1709
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細(xì)胞凍存

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:細(xì)胞室及工作臺紫外線照射15min;培養(yǎng)液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒溫水浴箱37℃預(yù)熱備用;收集對數(shù)生長期細(xì)胞,在凍存前一天換液

2.用吸管吸出培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗2遍吸出沖洗液,加入適量胰蛋白酶消化。

3. 適時去掉胰蛋白酶,加入少量新培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁上的細(xì)胞,使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。

4. 用吸管將培養(yǎng)液加入凍存管中,離心(1000r/min,10分鐘)。

5. 去上清液,加入與細(xì)胞懸液等量的凍存液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻

6. 冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16~18小時(或隔夜)---液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1h,以防止胞內(nèi)冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

7.記錄每一個冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時能夠找到每一個冷凍管。

細(xì)胞復(fù)蘇

室內(nèi)紫外消毒;培養(yǎng)基、PBS于37℃恒溫水浴預(yù)熱備用。
自液氮罐中取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,離心。
去上清,加入培養(yǎng)基,吹打,然后移入培養(yǎng)瓶中,用培養(yǎng)基清洗凍存管,清洗液也移入培養(yǎng)瓶中。
于培養(yǎng)瓶中加入適量培養(yǎng)基,放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
記錄復(fù)蘇日期;次日換液。

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