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miRNA定量及均一化cDNA文庫技術(shù)

時間:2011-9-23閱讀:1135
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進行一次逆轉(zhuǎn)錄即可實現(xiàn)所有目標miRNA的測定?沒錯,采用加尾法,一次逆轉(zhuǎn)錄就可以得到全部miRNA對應(yīng)的cDNA。

我們知道,真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,這樣Oligo-dT(逆轉(zhuǎn)錄引物)就很容易結(jié)合到mRNA上來合成cDNA了。

miRNA就缺了poly-A尾巴,怎么辦呢?在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中加入poly-A聚合酶,先給它們加上一串poly-A尾巴,然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉(zhuǎn)錄酶來合成cDNA。這樣一來,一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對應(yīng)的cDNA,接下來想用來檢測什么都可以!

您只需要提供1μg合格的total RNA,就可以對所有感興趣的miRNA進行檢測。這既可避免莖環(huán)法(各目標miRNA單獨逆轉(zhuǎn)錄)帶來的逆轉(zhuǎn)錄效率、加樣誤差等方面的影響,還可節(jié)約多條特異逆轉(zhuǎn)錄引物和多次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的花費,可謂一舉兩得,何樂而不為?

均一化cDNA文庫

基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異常常給文庫篩選和分析帶來障礙,采用均一化文庫技術(shù)可有效克服這一問題?!【换?cDNA 文庫具有以下4方面的優(yōu)點:*,在經(jīng)濟上具有廣泛的應(yīng)用空間,可以節(jié)約大量試驗成本。第二,增加克隆低豐度 mRNA 的機會,適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三,與原始豐度的 mRNA 拷貝數(shù)相對應(yīng)的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交,可以估計出大多數(shù)基因的表達水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構(gòu)建,忽略了 mRNA 豐度的影響。第四,可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規(guī)模的原位雜交,作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測序。

現(xiàn)在,在構(gòu)建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點:一種是基于復(fù)性動力學(xué)的原理,高豐度的 cDNA 在退火條件下復(fù)性的速度快,而低豐度的 cDNA 復(fù)性要很長時間,從而可以通過控制復(fù)性時間來降低豐度;另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質(zhì),通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。*種方法的掌握對技術(shù)的要求比較高,對多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到zui適條件;而后一種方法易于掌握,但有研究者根據(jù)復(fù)性動力學(xué)的原理也提出了其不利因素,即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數(shù)少而無法被雜交上。

DSN (duplexspecificenzyme) 是zui近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶(Shagin ., 2002)。該酶能夠選擇性降解雙鏈 DNA 和 DNARNA雜交體中的 DNA,對單鏈核酸分子幾乎沒有作用。同目前常用的均一化技術(shù)相比,基于 DSN 的均一化技術(shù)操作步驟簡單, 所需要的起始材料也比較少, 具有較好的應(yīng)用前景。

上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開展miRNA定量檢測服務(wù)已經(jīng)近三年時間,服務(wù)項目幾百個。擁有自己的miRNA引物庫(人類),對其他物種可以自行設(shè)計引物,檢測樣品范圍廣,包括:細胞、組織、血液、血漿、血清、細胞培養(yǎng)上清等,操作規(guī)范,時間可控,為廣大研究工作者提供了良好的便利。

同時,其作為國內(nèi)cDNA文庫構(gòu)建的主流服務(wù)供應(yīng)商,在長期穩(wěn)定的實驗服務(wù)過程中積累了豐富的經(jīng)驗,已經(jīng)成功構(gòu)建包括動物、植物、細菌等幾十個物種的cDNA文庫。他們基于雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)的先進cDNA文庫均一化技術(shù),能減低高豐度表達基因100倍以上,有效富集低豐度表達基因,從而降低冗余率。
 

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