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瓊脂擴散試驗
閱讀：343 發(fā)布時間：2011-1-21 可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴散，二者相遇，在比例合適處形成白色沉淀?；绢愋陀袉蜗驍U散和雙向擴散兩種。
（一）雙向瓊脂擴散試驗（Double immunodiffusion test）
抗原和抗體加到瓊脂板上相對應的孔中，兩者各自向四周擴散，如兩者相對應，濃度比例合適，則經(jīng)一定時間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線。每一抗原與其相對應抗體只能形成一條沉淀線，若同時含有若干對抗原抗體系統(tǒng)，因其擴散速度的不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。且根據(jù)沉淀線融合情況，還可鑒定兩種抗原是*相同還是部分相同。所以，可用此法來分析和鑒定標本中多種抗原或抗體成份，并用以測定抗原或抗體的效價。
【材料】羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制瓊脂粉，生理鹽水、載玻片，打孔器（直徑3mm）、濕盒、吸管等。
【方法】
1、用生理鹽水配制1.0～1.5%瓊脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁熱澆于載玻片上，制成瓊脂板。
2、待瓊脂凝固后，按右圖用打 孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂（孔距為5mm）。
3、在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。
4、將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)放置24小時后觀察結(jié)果。
1、用生理鹽水配制1.0～1.5%瓊脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁熱澆于載玻片上，制成瓊脂板。
2、待瓊脂凝固后，按右圖用打 孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂（孔距為5mm）。
3、在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。
4、將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)放置24小時后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
觀察孔間沉淀線的數(shù)目與特征，一般可注意到以下幾種現(xiàn)象：
1、抗原與抗體孔間形成一條沉淀線，說明只有一種抗原與相對應的抗體特異性結(jié)合，如出現(xiàn)數(shù)條沉淀線，說明有幾組不同的抗原和相對應抗體相結(jié)合。
2、根據(jù)抗原的成份可有以下三種現(xiàn)象：（1）若二孔中的抗原相同，與相應抗體形成的沉淀線融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，當抗血清中分別含有與抗原相應的抗體時，則形成的沉淀線相交叉；（3）若兩孔中抗原部分相同，抗血清中有各相應的抗體，形成的沉淀線相切。
3、相應抗原抗體所形成的沉淀線，如二者濃度相當，沉淀線在孔中央，二者濃度不當時，則沉淀線偏向濃度低的一側(cè)
觀察孔間沉淀線的數(shù)目與特征，一般可注意到以下幾種現(xiàn)象：
1、抗原與抗體孔間形成一條沉淀線，說明只有一種抗原與相對應的抗體特異性結(jié)合，如出現(xiàn)數(shù)條沉淀線，說明有幾組不同的抗原和相對應抗體相結(jié)合。
2、根據(jù)抗原的成份可有以下三種現(xiàn)象：（1）若二孔中的抗原相同，與相應抗體形成的沉淀線融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，當抗血清中分別含有與抗原相應的抗體時，則形成的沉淀線相交叉；（3）若兩孔中抗原部分相同，抗血清中有各相應的抗體，形成的沉淀線相切。
3、相應抗原抗體所形成的沉淀線，如二者濃度相當，沉淀線在孔中央，二者濃度不當時，則沉淀線偏向濃度低的一側(cè)
（二）單向瓊脂擴散試驗（Single immunodiffusion test）—人血清中IgG、IgA、IgM的測定。
單向瓊脂擴散試驗是一種定量試驗，將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔，再將抗原標本加入孔內(nèi)，經(jīng)過一定的時間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴散時間相關(guān)。用不同濃度的抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量即可從準標曲線中求出。本試驗主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補體成份的含量。
單向瓊脂擴散試驗是一種定量試驗，將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔，再將抗原標本加入孔內(nèi)，經(jīng)過一定的時間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴散時間相關(guān)。用不同濃度的抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量即可從準標曲線中求出。本試驗主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補體成份的含量。
【材料】
IgG、IgA、IgM免疫板、參考血清、待檢血清、微量加樣器（10微升）、量尺、紗布、生理鹽水、帶蓋方盤。
【方法】
1、免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥緩沖液配成），加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清（抗血清zui終稀釋度取決于抗血清所標化的稀釋度），混勻，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔，孔徑為3mm，孔距1～1.2cm。
2、稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用，參考血清、待檢血清稀釋按要求進行。
3、加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清，每個檢樣加兩個孔，每孔滴加10微升。
4、擴散：將免疫板置水平濕盤內(nèi)，放進37℃溫箱，IgG免疫板擴散24小時，IgA、IgM板48小時后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，（如果沉淀環(huán)不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時后觀察），必要時可以染色后觀察。
5、繪制標準曲線及血清標本中IgG、IgA、IgM定量測定：測量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān)，還與分子量和擴散時間有關(guān)。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系，這種關(guān)系有兩種計算方法：
（1）Mancini曲線－適用于大分子抗原和長時間擴散（＞48小時）的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C／d2 ＝K（C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)）。
（2）Fehey曲線－適用于小分子抗原和較短時間（24小時）擴散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線，濃度的對數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC／d＝K（C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)）。
【結(jié)果】免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批號的參考血清其免疫球蛋白含量不一。
IgG、IgA、IgM免疫板、參考血清、待檢血清、微量加樣器（10微升）、量尺、紗布、生理鹽水、帶蓋方盤。
【方法】
1、免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥緩沖液配成），加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清（抗血清zui終稀釋度取決于抗血清所標化的稀釋度），混勻，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔，孔徑為3mm，孔距1～1.2cm。
2、稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用，參考血清、待檢血清稀釋按要求進行。
3、加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清，每個檢樣加兩個孔，每孔滴加10微升。
4、擴散：將免疫板置水平濕盤內(nèi)，放進37℃溫箱，IgG免疫板擴散24小時，IgA、IgM板48小時后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，（如果沉淀環(huán)不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時后觀察），必要時可以染色后觀察。
5、繪制標準曲線及血清標本中IgG、IgA、IgM定量測定：測量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān)，還與分子量和擴散時間有關(guān)。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系，這種關(guān)系有兩種計算方法：
（1）Mancini曲線－適用于大分子抗原和長時間擴散（＞48小時）的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C／d2 ＝K（C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)）。
（2）Fehey曲線－適用于小分子抗原和較短時間（24小時）擴散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線，濃度的對數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC／d＝K（C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)）。
【結(jié)果】免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批號的參考血清其免疫球蛋白含量不一。