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酶法試劑盒操作步驟

時間:2024/5/31閱讀:624
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一、實驗原理
酶法試劑盒(ELISA)實驗原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性;使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。

二、操作步驟
1.ELISA在操作前試劑和組分都先恢復到室溫,標準品、質控品和樣品,建議做復孔。按前面試劑準備中描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。


2.設置標準品孔、樣本孔和空白孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,樣本孔加待測樣本50μL,空白孔不加。除空白孔外,標準品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。


3.溫育好后揭開封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置20s,甩去洗滌液,吸水紙上拍干。如此重復4次(共洗板5次)。若使用自動洗板機,請按洗板機操作程序進行洗板,添加浸泡20s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應板。洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻決定著實驗的成敗。

ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來??梢哉f在ELISA 操作中,洗滌是主要的關鍵技術,應引起操作者的高度重視,操作者應嚴格按要求洗滌,不得馬虎。
   
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔加入終止液50μL,在酶標儀上讀取各孔吸光度(OD值)。
   
5.檢測完成后,以標準品濃度做為縱坐標,對應的吸光度(OD值)作為橫坐標,利用計算機軟件,采用四參數Logistic曲線擬合(4-pl),創(chuàng)建標準曲線方程,通過樣本的吸光度(OD值),利用方程計算樣品的濃度值。如果樣品被稀釋,通過上述方法測的的濃度值,要乘以稀釋倍數,才是樣品的終濃度。


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