在ELISA中，用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物，此為進(jìn)行ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結(jié)合物，而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。

    那么用什么樣的酶來標(biāo)記抗原或抗體呢？

    1.酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數(shù)大(即一個(gè)酶分子能催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)的酶)。

    2.酶及制備好的酶結(jié)合物在檢測(cè)或貯存中能保持穩(wěn)定。

    3.酶制劑易得、價(jià)廉.

    4.既要適用于標(biāo)記抗原，又適用于標(biāo)記抗體，標(biāo)記后不影響抗原或抗體的免疫學(xué)特性，也不降低酶的活性。

    5.酶的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)簡便、快速。在定量測(cè)定中產(chǎn)物必須是可溶性的。

    6.要有安全、價(jià)廉、易得的底物。

    符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105(Alkaline Phospatase,簡稱AP)，辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104),另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種(AP和HRP)zui為常用。

    AP活力高，制備好的酶結(jié)合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取，而且價(jià)格比較昂貴。因此，目前國內(nèi)外大多使用HRP。HRP活性也高，價(jià)格較便宜。但制得酶結(jié)合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。

   結(jié)合：用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結(jié)合起來呢？當(dāng)然不能用強(qiáng)烈的方法，因?yàn)閺?qiáng)烈的方法會(huì)使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結(jié)合起來。因此，必須使用結(jié)合劑。理想的結(jié)合劑應(yīng)具備下列條件：

1.不影響酶及抗體活性；

2.不產(chǎn)生干擾物質(zhì)；

3.抗體和酶結(jié)合后應(yīng)有較高的產(chǎn)量；

4.不出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；

5.結(jié)合程序簡便；

6.來源易、價(jià)廉。

目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對(duì)所使用結(jié)合劑的針對(duì)性，因此標(biāo)記的方法也有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鈉氧化法兩類。