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細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒

時(shí)間：2010/5/13閱讀：3673

細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒（Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit）

提供了一種簡(jiǎn)單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提核蛋白與漿蛋白的方法。約

90 分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的核蛋白與漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白為非變性，

有活性，可以用于Western、EMSA、footprinting、報(bào)告基因檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等

后續(xù)操作。本試劑盒是通過(guò)細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A 和B，在低滲透壓條件下，使細(xì)

胞充分膨脹后破壞細(xì)胞膜，釋放出漿蛋白，然后通過(guò)離心得到細(xì)胞核沉淀。zui后通

過(guò)高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到核蛋白。本試劑盒可以抽提50 個(gè)，數(shù)量為

2×106 個(gè)Hela 細(xì)胞（約40mg）的樣品?？筛鶕?jù)需要按比例放大，縮小提取規(guī)模。

Elisa試劑盒 11:21:57
v 注意事項(xiàng)：

1. 需自備PMSF， PMSF 一定要在抽提試劑加入到樣品前2-3 分鐘內(nèi)加入，以免

PMSF 在水溶液中很快失效。

2. 抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

3. 對(duì)于組織樣品，本試劑盒僅適合于新鮮組織，對(duì)凍存過(guò)的組織抽提效果差?？?/a>

以抽提的組織樣品數(shù)通常不足50 個(gè)。

4. 使用本試劑盒抽提得到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白都可以直接用博邁德生產(chǎn)的

BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。但不適合用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

Elisa試劑盒 11:22:56
v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)

量的CER A 備用，在需要加入前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF 至終濃度為1mM。取適當(dāng)量

的NER 備用，在需要加入前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF 至終濃度為1mM。如果目標(biāo)蛋白

含豐富的半胱氨酸，可在CER A、NER 中加入DTT 至終濃度0.5mM。

1. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：用PBS 洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA 溶液處理細(xì)胞

使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打細(xì)胞（不用胰酶消化，因?yàn)榭赡芙到獾?/a>

白）。500×g 離心2-3 分鐘，盡可能吸棄上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用

胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。接步驟4。

2. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：用PBS 洗一遍，500xg 離心2-3 分鐘，盡可能吸棄上清，留下細(xì)

胞沉淀備用。接步驟4。

3. 對(duì)于新鮮組織：

1）把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。在PBS 里面勻漿制成細(xì)胞懸液，500xg 離心

2-3 分鐘，棄上清，估計(jì)細(xì)胞沉淀體積，接步驟4。

2）把組織稱(chēng)重后，把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片，按照每50 毫克組織加入500

微升的比例加入CER A，勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，接步驟5。在步

驟7 按照每200 微升CER A 加11 微升比例加入CER B。

4. 每20 微升細(xì)胞沉淀加入200 微升添加了PMSF 的CER A。（對(duì)于2×106 個(gè)Hela 細(xì)

胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20 微升或40 毫克。）

5. zui高速劇烈Vortex 15 秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。（如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有完

全懸浮并分散開(kāi)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)Vortex 時(shí)間。）

6. 冰浴10-15 分鐘。

7. 加入CER B 11 微升。zui高速劇烈Vortex 5 秒，冰浴1 分鐘。

8. zui高速劇烈Vortex 5 秒，4℃ 14,000-16,000g 離心5 分鐘。

9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，

也可以凍存。（千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸

及沉淀。）

10. 對(duì)于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50 微升添加了PMSF 的NER。（不吸盡上

清會(huì)污染有細(xì)胞漿蛋白。）

11. zui高速劇烈Vortex 15-30 秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，

每隔10 分鐘再高速劇烈Vortex 15－30 秒，共40 分鐘。

試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

Cytoplasmic Extraction Reagent A（CER A） 4°C. 10ml

Cytoplasmic Extraction Reagent B（CER B） 4°C. 0.55ml

Nuclear Extraction Reagent （NER） 4°C. 2.5ml

12. 4℃ 14,000－16,000xg 離心10 分鐘。

13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，

也可以-70℃凍存。

Elisa試劑盒 11:23:54
v 問(wèn)題與解決方法

胞漿蛋白產(chǎn)量低

細(xì)胞沒(méi)有裂解*-建議：增加CER B 用量比例

細(xì)胞團(tuán)分散不*-建議：Votex 劇烈*

胞核蛋白產(chǎn)量低

細(xì)胞團(tuán)分散不*-建議：Votex 劇烈*

不*細(xì)胞核分離-建議：加入CER B 后，加大離心時(shí)間

蛋白濃度低

抽提試劑和細(xì)胞團(tuán)的體積比例不適和-建議：按照20 微升細(xì)胞

團(tuán)（約40mg）比例加200 微升CER A

蛋白活性低

或者沒(méi)有活性

樣品沒(méi)有保持低溫操作-建議：始終低溫離心和保持樣品在冰上

蛋白酶活性偏高-建議：除了PMSF，可加入多種protease inhibitor

細(xì)胞漿抽提物（胞漿蛋白）未*清除-建議：細(xì)胞核抽提前，

仔細(xì)吸去所有的胞漿抽提上清

細(xì)胞裂解不*-建議：加大Votex 時(shí)間和冰浴時(shí)間

細(xì)胞裂解過(guò)度-建議：減少Votex 時(shí)間和冰浴時(shí)間

勻漿過(guò)度，不足或者不均勻-建議：優(yōu)化勻漿時(shí)間和條件

胞漿/胞核蛋白

產(chǎn)量同時(shí)低

可能和細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)-建議：該種細(xì)胞系可能不適合本方法

裂解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)

變得十分粘稠

或者顯微鏡下

發(fā)現(xiàn)胞核裂解

裂解過(guò)度，胞核也*裂解，DNA 釋放出來(lái)了。-建議：減少

CER B 用量比例或者不加；減少Votex 時(shí)間和冰浴時(shí)間。

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細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒

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