選擇一種恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是影響基因表達的關(guān)鍵因素。請看ELISA試劑盒嘗試利用10種不同的質(zhì)粒構(gòu)建成的融合質(zhì)粒表達相同的蟲熒光素酶報告基因，這10種融合質(zhì)粒表達出的蟲熒光素酶基因的表達水平各異。ELISA試劑盒告訴您影響基因表達的質(zhì)粒因素。蟲熒光素酶報告基因表達水平依賴于空載質(zhì)粒的類型。以上是蟲熒光素酶報告基因在THP1和HUVEC細胞中在4小時、24小時和48小時中的表達水平。在THP1細胞中，質(zhì)粒DNA的量為0.3-0.5μg。HUVEC細胞中質(zhì)粒DNA的量為2.5-4.4μg。
啟動子的類型是否適用于現(xiàn)在的細胞類型？ELISA試劑盒展示了在不同的細胞類型中啟動子的強度時不同的。盡管CMV在大多數(shù)哺乳動物細胞中屬于較強的啟動子，但是另外的啟動子可能會在我們研究的這種細胞中有較強的表達(例如BHK-21細胞中SV40啟動子)。
內(nèi)含子
的基因表達需要基本的內(nèi)含子的剪切，然而這個觀點并不是總被大家認可。內(nèi)含子的位置和強度會影響轉(zhuǎn)錄、mRNA的輸出和聚腺苷酸化。這樣，依賴于內(nèi)含子的位置，內(nèi)含子甚至?xí)?dǎo)致基因表達的降解。
IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)
內(nèi)核糖體剪切位點質(zhì)粒，啟動子驅(qū)動兩種基因的表達，一個是感興趣的克隆基因(經(jīng)常是處在上游基因)，另一個是報告基因，通常編碼GFP蛋白。IRES質(zhì)粒表達的mRNA是雙順反子信使，意味著兩個基因都在相同的mRNA分子上。兩種基因的雙順反子數(shù)量是一樣的，但是兩種基因的翻譯起始水平存在很大的不同。核糖體結(jié)合上游基因的起始位點是相當(dāng)有效的，然而IRES卻會讓核糖體與下游基因的結(jié)合和翻譯處于一個較低的水平。下游基因通常是GFP，因此GFP的表達水平就會低于沒有IRES序列的質(zhì)粒表達。而通常沒有IRES序列的GFP質(zhì)粒的表達水平我們認為是正常的。可以通過構(gòu)建兩種基因的融合質(zhì)?；蛘吖厕D(zhuǎn)染實現(xiàn)表達相同數(shù)量的感興趣的蛋白和GFP蛋白。
LTR(病毒長的末端重復(fù))
許多質(zhì)粒的表達利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR的啟動子和增強子，然而當(dāng)這些質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進入特定類型的細胞中時，可能會受到這些細胞對于其表達的抑制。盡管這種抑制機制未*闡明，很有可能是因為來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子或者增強子在某些原代細胞或者細胞系中不能很好的工作。*的解決辦法就是利用傳統(tǒng)的啟動子例如CMV(e.g.,pmaxCloning Vector),EF1a或者SV-40將基因重新克隆至新的載體上。
ELISA試劑盒質(zhì)粒的大小在實驗室中我們通常會使用4-7kb的質(zhì)粒，而Lonza的Nucleofection可以轉(zhuǎn)染長至20kb的質(zhì)粒。若是更長的質(zhì)?？赡軙?dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的降低。通常的規(guī)則是，質(zhì)粒長度越長，越難進入到細胞內(nèi)。這個規(guī)則適用于電穿孔的方法以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法。