細胞培養(yǎng)經常需要獲得單克隆,下面就給大家簡單介紹幾種方法:
方法一:單克隆細胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應保證每個孔中的細胞是一個,因此,在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結果培養(yǎng)SPC-A1(人肺癌細胞),轉染了EGFP,然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選,zui終獲得了成功。
方法二:實驗步驟大致為:預先對96孔板除*排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液,0.1ml/孔,并放于細胞培養(yǎng)箱中溫育,然后胰酶消化穩(wěn)定表達GFP的細胞,細胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸浮液,上述細胞液接種于96孔板的*排,0.2ml/孔,從中吸取0.1ml細胞溶液接種于第二排,混合后,從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……,一直到第八排,zui后一排都丟棄0.1ml細胞液。一般來說,每一列都會有某個孔中只有1~2個細胞。
方法三:在顯微鏡下觀察,標記孔中小于10個細胞的孔,然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細胞圈住,然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細胞戳死,這樣留在孔中的就是單克隆了,通過這樣的,獲得了單克隆。但需注意的是:時間不能超過30min,否則細胞極容易死亡。
解決操作時間長的方法:拿一個96板,在里面隨便種一些細胞,然后用牙簽練習,我練了5~6次后非常熟練了。還有注意培養(yǎng)液:是含15%的胎牛血清,加大營養(yǎng),有利于細胞生長;另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾,過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子,可以作為單克隆的培養(yǎng)液。