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上海復(fù)祥生物科技有限公司

養(yǎng)好細(xì)胞注意點(diǎn)(二)

時(shí)間:2017-3-24閱讀:3818

(一)何時(shí)須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素。

 

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

 

一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中可以添加抗生素。 按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。

 

(二)貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理

 

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低,并可減少污染的機(jī)會(huì).。

 

(三)將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),離心速率多少

 

回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為 1 000 rpm,5~10 分鐘,過(guò)高的轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。

 

(四)細(xì)胞的接種密度

 

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

 

(五)細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)

 

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí),必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ,其本身即為無(wú)菌狀況,*次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中避光保存。

 

 

(六)冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度

 

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集,懸浮細(xì)胞直接離心收集,以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1~2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

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