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細胞凋亡晚期檢測技術(shù)
閱讀：1074 發(fā)布時間：2021-1-19晚期檢測：
細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：
1.TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，介導(dǎo)熒光標記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。
2.LM-PCR Ladder （連接介導(dǎo)的PCR檢測）
當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3.emerase Detection （端粒酶檢測）
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細胞獲得“永生化"。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復(fù)制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze emerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細胞凋亡的發(fā)生。