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細(xì)胞凋亡晚期檢測技術(shù)
閱讀：1073 發(fā)布時(shí)間：2021-1-19晚期檢測：
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：
1.TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。美國Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡便。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測靈敏度高。
2.LM-PCR Ladder （連接介導(dǎo)的PCR檢測）
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。
上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會(huì)受到其它原因的干擾。
3.emerase Detection （端粒酶檢測）
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化"。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze emerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。