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    在Elisa實(shí)驗(yàn)過程中，關(guān)鍵步驟的操作要領(lǐng)需要熟練掌握。在實(shí)驗(yàn)的影響因素中，使用儀器要求、試驗(yàn)的重復(fù)性、樣品的稀釋等，在后面的技術(shù)內(nèi)容中，上海恒遠(yuǎn)生物公司會(huì)為大家逐一介紹。今天我們來看一看，論Elisa試劑盒抗原對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作影響：

    Elisa中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗(yàn)結(jié)果都有影響。

    包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。經(jīng)試驗(yàn)證明，適用于其他血清學(xué)試驗(yàn)的抗原并非均適合用于Elisa法。

    因此，對某一疾病的診斷，必須通過實(shí)踐，才能選出適用的抗原。對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷中所用的抗原并非要求十分嚴(yán)格，一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的可溶性抗原均可用于Elisa，例如超聲波抗原、凍融抗原、細(xì)菌的外膜抗原、脂多糖(LPS)、細(xì)菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作Elisa時(shí)，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。

    此外，對某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時(shí)也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時(shí)選擇的濃度要適當(dāng)。如濃度太高，則低效價(jià)抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復(fù)性。 

    用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進(jìn)行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進(jìn)行測定，但用單項(xiàng)滴定法更為簡便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別?？乖还滔噍d體除濃度外，對時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高(如37℃、45℃、或56℃)，包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長包被時(shí)間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過一夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下(如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原)4℃包被過一夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過滴定。

    血清、血漿或其他體液，均可作為Elisa試驗(yàn)樣品(標(biāo)本)。但應(yīng)注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱(4℃)中凝固，否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過程中抗體的穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作Elisa血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血，而血清可用濾紙片法采血。

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