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Elisa試劑盒抗原對整個實驗的操作影響
閱讀：506 發(fā)布時間：2016-1-27在Elisa實驗過程中，關鍵步驟的操作要領需要熟練掌握。在實驗的影響因素中，使用儀器要求、試驗的重復性、樣品的稀釋等，在后面的技術內容中，上海恒遠生物公司會為大家逐一介紹。今天我們來看一看，論Elisa試劑盒抗原對整個實驗的操作影響：
Elisa中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。
包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于Elisa法。
因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于Elisa，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖(LPS)、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作Elisa時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。
此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。
用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別?？乖还滔噍d體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高(如37℃、45℃、或56℃)，包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過一夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下(如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原)4℃包被過一夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。
血清、血漿或其他體液，均可作為Elisa試驗樣品(標本)。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱(4℃)中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關于人血清在保存過程中抗體的穩(wěn)定性報導尚不多。但一般認為作Elisa血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
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