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檢測細(xì)胞凋亡:DNA ladder法
閱讀：3024 發(fā)布時(shí)間：2012-10-10
發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸酶被激活，染色體DNA鏈在核小體之間被切割，形成180～200個(gè)堿基或其整數(shù)倍的DNA的片段，將這些DNA的片段抽提出來進(jìn)行電泳，可得到DNA梯狀條帶（DNA ladder）。
一、材料與試劑
蛋白酶K（500μg/ml）
8mol/L 醋酸鉀
白細(xì)胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1% SDS。
氯仿
無水乙醇，70%乙醇；
2%瓊脂糖凝膠。
二、操作步驟
1. 收集凋亡細(xì)胞：取1～2×106 個(gè)細(xì)胞，離心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h；
2. 洗滌：取出酒精固定的細(xì)胞，1000r/min離心5min ，去掉上清液，PBS洗二次；
3. 裂解細(xì)胞：加400μl細(xì)胞裂解液，充分混勻再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小時(shí)或過夜；
4. 蛋白處理：加75μl 8mol/L的醋酸鉀，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混勻后，10000r/min離心10分鐘后，將上清移至一新的Eppendorf管中；
5. 沉淀DNA：加入750μl無水乙醇，上下輕柔顛倒混合，即可見乳白色沉淀，若不明顯時(shí)可置-20℃過夜，12000r/min離心10分鐘，去上清；
6. 洗滌DNA：加1ml70%乙醇，混勻，10000r/min 離心5min，去上清；
7. 溶解DNA：根據(jù) DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸餾水或TE，37℃溶解；
8. 測定DNA濃度；
9. 2%瓊脂糖凝膠電泳80V 2小時(shí)；
三、結(jié)果判斷
出現(xiàn)梯狀電泳條帶，zui小的條帶為180～200 bp，其他的條帶為其整倍數(shù)大小。壞死細(xì)胞則出現(xiàn)彌散的電泳條帶，無清晰可見的條帶。正常細(xì)胞DNA基因條帶因分子量大，遷移距離短，故停留在加樣孔附近。