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細(xì)胞凋亡檢測操作步驟之ELISA法
閱讀：767 發(fā)布時(shí)間：2016-9-1細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將分解核小體區(qū)間的雙鏈DNA，但核小體本身由于由組蛋白緊密結(jié)合而免受切割，單克隆抗體可以與核小體形成夾心結(jié)構(gòu)，可通過檢測核小體判斷細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡事件。
(一) 原理
細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp～200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。
(二)材料與試劑
1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。
2.過氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體
3.鏈霉親合素包被的微孔板
4.DNA-組蛋白復(fù)合物，作為陰性對照。
5.ABTS底物
6.溶解緩沖液
7.溫育緩沖液
8.底物緩沖液
(三)樣品
1.培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。
2.培養(yǎng)細(xì)胞的上清液
3.血漿(血清)
(四)操作方法
1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。
2.另加入80µl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合)，室溫下孵育2h(置搖床上，250r/min)。
3.取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。
4.加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。
5.盡快作比色分析(10min～20min內(nèi))，用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進(jìn)行檢測。
(五)結(jié)果判定
按下列公式計(jì)算細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：
注：mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測。
小結(jié)：這里總結(jié)了ELISA法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理、試劑配制、操作步驟，希望對大家有用呢，有不當(dāng)?shù)牡胤剑€望指正。細(xì)胞凋亡檢測更多詳情，可點(diǎn)擊查看