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          上海恒遠生物解析檢測VEGF促進血管內(nèi)皮細胞增殖活性的方法

血管生成（Angiogenesis）是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管內(nèi)皮細胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網(wǎng)，是一個涉及多種細胞的多種分子的復雜過程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復雜過程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會激活血管系統(tǒng)，使血管生成過度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。

1．用牛腎上腺內(nèi)皮細胞（AEC）檢測VEGF活性

1）取12孔細胞培養(yǎng)板，每孔加0.5ml含1×10⁴牛腎上腺血管內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)液。

2）用含0.2％明膠的PBS系列稀釋待測樣品，每孔加0.5ml稀釋樣品，以后隔天更換同樣濃度的稀釋樣品；對照孔加0.5ml細胞培養(yǎng)液。在37℃ 5％ CO₂的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5天。

3）用MTT法、[³H]脫氧胸苷摻入法或直接用胰蛋白酶消化后計數(shù)細胞的方法計數(shù)生長的細胞數(shù)。繪制劑量-反應(yīng)曲線，取能引起50％zui大增殖反應(yīng)的zui高樣品稀釋度為1U VEGF。

上海恒遠生物供應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子試劑盒（英文：vascular endothelial growth factor，簡稱：VEGF），早期亦稱作血管通透因子（英文：vascular permeability factor，簡稱：VPF)，是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子（heparin-binding growth factor），可在體內(nèi)誘導血管新生（induce angiogenesis in vivo）。本月主推大鼠，小鼠，人等種屬試劑盒，咨詢。

2．用人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞（HUVE）檢測VEGF活性

1）分離HUVE。取明膠包被的48孔細胞培養(yǎng)板，每孔加6000個細胞，含15mmol/L Hepes、20％胎牛血清和抗生素的199培養(yǎng)液，以及用同樣培養(yǎng)液系列稀釋的待測樣品，總體積0.4ml。在37℃ 5％ CO₂的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。

2）加入0.64μCi（23.68kBq）[³H]脫氧胸苷，繼續(xù)培養(yǎng)60小時，用含1％ BSA的pH7.5 Hank液洗滌各孔。用含0.1mol/L NaOH的0.2mol/L Na₂CO₃溶液溶解細胞，釋放DNA。溶解物在液體閃爍計數(shù)儀上計數(shù)放射性摻入量，同上決定樣品中VEGF的含量。