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普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 對比分析
提起 PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳，**，其影響之深，應(yīng)用之廣可見一斑。
1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能率的進(jìn)行，隨后 PE-Cetus 公司推出了臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
根據(jù) PCR 的發(fā)展進(jìn)程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進(jìn)行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。
普通 PCR
基本原理
PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外 DNA 擴增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。
PCR 反應(yīng)體系舉例
10×擴增緩沖液 | 10µl |
4 種 dNTP 混合物 | 各 100～250μmol/L |
引物 | 各 5～20μmol/L |
模板 DNA | 0.1～2µg |
Taq DNA 聚合酶 | 5~10U |
Mg2+ | 1～3mmol/L |
加雙或三蒸水至 | 100µl |
儀器與耗材
基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。
結(jié)果檢測
PCR 反應(yīng)擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。
應(yīng)用
PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進(jìn)行比對。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。
實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程。
根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系， 只要對熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。
模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標(biāo)記方法
方法 | 優(yōu)點 | 缺點 | 應(yīng)用范圍 |
SYBR Green I | 適用性廣 靈敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出現(xiàn)非特異條帶 | 科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物研究 |
Taqman | 特異性高 重復(fù)性好 | 價格高 只適合特定目標(biāo) | 病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
分子信標(biāo) | 高特異性 熒光背景低 | 只適合特定目標(biāo) 設(shè)計困難 價格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
熒光定量 PCR 反應(yīng)體系舉例 | |
試劑 | 含量 |
2xGoTaq Master Mix | 5µl |
無核酸酶水 | 3.5µl |
上游引物 | 0.25µl |
下游引物 | 0.25µl |
基因組 DNA | 1µl（約20ng）梯度稀釋 |
共 10µl | |
儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構(gòu)。
