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熒光定量pcr儀的使用方法
什么是數(shù)字PCR?
數(shù)字PCR是一種新的定量PCR,通過對PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋,隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增,后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。
什么是多重PCR?
多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物,同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng);由Chambehian'于1988年*提出,其反應(yīng)原理,反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴(kuò)增的引物對數(shù)量是有限的。
什么是多重數(shù)字PCR?
多重數(shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應(yīng)體系里加上兩對或兩對以上引物,同時擴(kuò)增出多個核酸片段的數(shù)字PCR反應(yīng)。將多重PCR技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的多重數(shù)字PCR,根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴(kuò)增不同循環(huán)數(shù)及多種標(biāo)記熒光同時使用,便可大幅提高數(shù)字PCR多重性,多重性可達(dá)20-50以上,即同時在一個PCR反應(yīng)單元內(nèi)進(jìn)行20-50個以上的數(shù)字PCR反應(yīng)。
多重數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)檢測中的優(yōu)勢
在數(shù)字PCR中實現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測能顯著降低檢測成本,獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應(yīng)中完成基因多個突變位點的檢測,即一個PCR反應(yīng)即可完成一個Panel的檢測,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著不可替代的優(yōu)勢。
其優(yōu)勢可以簡單概括為以下三點:
1高效性。
在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種核酸片段,或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型,特別是用一滴血就可檢測多種病原體。
2系統(tǒng)性。
多重數(shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測,如肝炎病毒,腸道致病性細(xì)菌,性病,無芽胞厭氧菌。
3經(jīng)濟(jì)簡便性。
多種核酸片段在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出,節(jié)省時間、試劑耗材和經(jīng)費,為臨床提供更多更準(zhǔn)確的檢測信息。
多重數(shù)字PCR的檢測類型
數(shù)字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn):
1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標(biāo)記不同的要檢測的靶基因。
2、單波長多強(qiáng)度。使用一種熒光染料,但是擴(kuò)增結(jié)束時不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強(qiáng)度不一樣。
多重數(shù)字PCR在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用舉例:
1.多重數(shù)字pcr技術(shù)檢測肺癌EGFR基因突變
來源:Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166
EGFR基因突變位點的檢測是指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中常見的是21號外顯子L858R突變,19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的,尤其是液態(tài)活檢樣本,因此多重檢測可以節(jié)省大量檢測樣本及檢測成本。
2,多重數(shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用
來源:Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247
High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes
數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和定量的能力,能夠區(qū)分微小差異,很適合用來進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分,常規(guī)實驗一對引物探針要想準(zhǔn)確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板(約41-252ng,胎兒DNA比例10%-4%),這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA),這時通過多重數(shù)字PCR設(shè)計40對引物和2個通用探針擴(kuò)增21號和18號染色體上的各20個片段,就能很好的解決這個問題。結(jié)果顯示以10ng cfDNA作為起始模板,使用多重數(shù)字PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確性分辨21-三體綜合征。
3.探針成本太高,沒關(guān)系我們用染料法也可以做多重數(shù)字PCR
來源:Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27
通過改變擴(kuò)增產(chǎn)物的長度,或者調(diào)整引物的量,或者改變反應(yīng)的Tm值等條件,可以輕松嘗試多重數(shù)字PCR反應(yīng)。
4.染料法也可以檢測點突變
染料法也可以檢測SNP點突變,通過在上游引物末端添加一段序列,改變突變型或野生型擴(kuò)增產(chǎn)物長度即可輕松實現(xiàn)多重檢測。
1.儀器的檢測通量(Throughput)
首先要考慮實驗室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示,如果不是大規(guī)模批量使用,比如說主要是用來檢測驗已知基因,那確實不需要昂貴的產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點和疾病標(biāo)記的實驗室,就需要能容納384孔板、運行時間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的,你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實驗室往往需要進(jìn)一步的自動化儀器,只要“按一下鈕”,儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
2.多重擴(kuò)增的能力
多重擴(kuò)增越來越熱。實時定量PCR儀也不能幸免。定量PCR儀擁有多個檢測通道,因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴(kuò)增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道,比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P,也就是4個檢測通道。不過多重擴(kuò)增并非人人適用,因為它使實驗復(fù)雜化了。
3.軟件
當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺定量PCR儀,你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎,是否可以進(jìn)行你所需要的分析,輸出格式有幾種。不過,你需要留意,太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進(jìn)行復(fù)雜計算,以前的軟件還需要你做進(jìn)一步分析,新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能,部分軟件還可以有更多的功能,比如引物和探針設(shè)計、多重分析設(shè)計、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強(qiáng)調(diào):定量PCR是一個幾何擴(kuò)增的過程,開始時一個拷貝之差,結(jié)果就有幾何數(shù)量級之別。
4.靈活性
大規(guī)模繁忙的實驗室設(shè)備*固然令人羨慕,常規(guī)的實驗室同樣可以有精彩的選擇?,F(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家,不單了解你的目前需要,還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化,比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實時定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽,可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實驗室來說,SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇,一個基本模塊有16個獨立控溫樣品槽,可以同時或者前后分別進(jìn)行16個*獨立的不同實驗, “隨機(jī)存取”;當(dāng)實驗室需要較大規(guī)模實驗時,可以非常經(jīng)濟(jì)地升級,從1個增加到6個基本模塊,也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板,但是當(dāng)一個學(xué)生開始小量實驗,其他人還可以隨時插進(jìn)去開始自己的獨立實驗,而且互不干擾,就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實驗而且預(yù)算較緊張的實驗室來說是非常靈活的選擇。
5.不確定性
盡管軟件可以做部分修正,購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器,無需那么多計算修正總比靠計算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為,要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異,還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試,他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進(jìn)行實時擴(kuò)增。很不幸,很多時候,不同樣品孔之間會有不同的結(jié)果。