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熒光定量pcr儀的使用方法
什么是數(shù)字PCR？
數(shù)字PCR是一種新的定量PCR，通過對PCR反應(yīng)物進行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進行PCR擴增，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。
什么是多重PCR？
多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)；由Chambehian'于1988年*提出,其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的。
什么是多重數(shù)字PCR？
多重數(shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應(yīng)體系里加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的數(shù)字PCR反應(yīng)。將多重PCR技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)有機結(jié)合而形成的多重數(shù)字PCR，根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴增不同循環(huán)數(shù)及多種標(biāo)記熒光同時使用，便可大幅提高數(shù)字PCR多重性，多重性可達20-50以上，即同時在一個PCR反應(yīng)單元內(nèi)進行20-50個以上的數(shù)字PCR反應(yīng)。
多重數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)檢測中的優(yōu)勢
在數(shù)字PCR中實現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應(yīng)中完成基因多個突變位點的檢測，即一個PCR反應(yīng)即可完成一個Panel的檢測，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著不可替代的優(yōu)勢。
其優(yōu)勢可以簡單概括為以下三點：
1高效性。
在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種核酸片段，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。
2系統(tǒng)性。
多重數(shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌。
3經(jīng)濟簡便性。
多種核酸片段在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，節(jié)省時間、試劑耗材和經(jīng)費，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的檢測信息。
多重數(shù)字PCR的檢測類型
數(shù)字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn)：
1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標(biāo)記不同的要檢測的靶基因。
2、單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結(jié)束時不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強度不一樣。
多重數(shù)字PCR在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用舉例：
1.多重數(shù)字pcr技術(shù)檢測肺癌EGFR基因突變
來源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166
EGFR基因突變位點的檢測是指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中常見的是21號外顯子L858R突變，19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的，尤其是液態(tài)活檢樣本，因此多重檢測可以節(jié)省大量檢測樣本及檢測成本。
2，多重數(shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用
來源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247
High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes
數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和定量的能力，能夠區(qū)分微小差異，很適合用來進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分，常規(guī)實驗一對引物探針要想準(zhǔn)確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板（約41-252ng，胎兒DNA比例10%-4%），這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA)，這時通過多重數(shù)字PCR設(shè)計40對引物和2個通用探針擴增21號和18號染色體上的各20個片段，就能很好的解決這個問題。結(jié)果顯示以10ng cfDNA作為起始模板，使用多重數(shù)字PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確性分辨21-三體綜合征。
3.探針成本太高，沒關(guān)系我們用染料法也可以做多重數(shù)字PCR
來源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27
通過改變擴增產(chǎn)物的長度，或者調(diào)整引物的量，或者改變反應(yīng)的Tm值等條件，可以輕松嘗試多重數(shù)字PCR反應(yīng)。
4.染料法也可以檢測點突變
染料法也可以檢測SNP點突變，通過在上游引物末端添加一段序列，改變突變型或野生型擴增產(chǎn)物長度即可輕松實現(xiàn)多重檢測。
1.儀器的檢測通量（Throughput）
首先要考慮實驗室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示，如果不是大規(guī)模批量使用，比如說主要是用來檢測驗已知基因，那確實不需要昂貴的產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點和疾病標(biāo)記的實驗室，就需要能容納384孔板、運行時間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實驗室往往需要進一步的自動化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
2.多重擴增的能力
多重擴增越來越熱。實時定量PCR儀也不能幸免。定量PCR儀擁有多個檢測通道，因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道，比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個檢測通道。不過多重擴增并非人人適用，因為它使實驗復(fù)雜化了。
3．軟件
當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺定量PCR儀，你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進行復(fù)雜計算，以前的軟件還需要你做進一步分析，新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設(shè)計、多重分析設(shè)計、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強調(diào)：定量PCR是一個幾何擴增的過程，開始時一個拷貝之差，結(jié)果就有幾何數(shù)量級之別。
4.靈活性
大規(guī)模繁忙的實驗室設(shè)備*固然令人羨慕，常規(guī)的實驗室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實時定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實驗室來說，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇，一個基本模塊有16個獨立控溫樣品槽，可以同時或者前后分別進行16個*獨立的不同實驗， “隨機存取”；當(dāng)實驗室需要較大規(guī)模實驗時，可以非常經(jīng)濟地升級，從1個增加到6個基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當(dāng)一個學(xué)生開始小量實驗，其他人還可以隨時插進去開始自己的獨立實驗，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實驗而且預(yù)算較緊張的實驗室來說是非常靈活的選擇。
5.不確定性
盡管軟件可以做部分修正，購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器，無需那么多計算修正總比靠計算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試，他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進行實時擴增。很不幸，很多時候，不同樣品孔之間會有不同的結(jié)果。