您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品分類品牌分類
-
混勻儀|混合器 氣體發(fā)生器 分光測色計 勻漿機(jī) 研磨機(jī) 超凈工作臺 洗板機(jī) 高低溫試驗箱 恒溫金屬浴 電阻爐 溶劑過濾器 漩渦混合儀|旋渦混勻儀 均質(zhì)器 水槽 恒溫水槽 手套 培養(yǎng)板 生物安全柜 天平 滴定管 瓶口分液器 光澤儀 錐入度儀 濁度計 分析儀 冷藏保存箱 色差儀 超純水機(jī) 預(yù)制冷槽 油浴槽 冷卻水循環(huán)裝置 溶媒回收裝置 恒溫水浴槽 液氮罐 馬弗爐 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 電泳儀 潔凈工作臺 干燥箱 磁力攪拌器 滅菌器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 低溫冰箱 防爆冰箱 離心機(jī) 振蕩器 移液器 真空泵
實時熒光定量PCR工作原理
實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程。
根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光強(qiáng)度與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系， 只要對熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
Ct 值指 PCR 擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。
模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標(biāo)記方法
方法 | 優(yōu)點 | 缺點 | 應(yīng)用范圍 |
SYBR Green I | 適用性廣 靈敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出現(xiàn)非特異條帶 | 科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物研究 |
Taqman | 特異性高 重復(fù)性好 | 價格高 只適合特定目標(biāo) | 病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
分子信標(biāo) | 高特異性 熒光背景低 | 只適合特定目標(biāo) 設(shè)計困難 價格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
熒光定量 PCR 反應(yīng)體系舉例 | |
試劑 | 含量 |
2xGoTaq Master Mix | 5µl |
無核酸酶水 | 3.5µl |
上游引物 | 0.25µl |
下游引物 | 0.25µl |
基因組 DNA | 1µl（約20ng）梯度稀釋 |
共 10µl | |
儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴(kuò)增原理和普通 PCR 儀擴(kuò)增原理相同，只是 PCR 擴(kuò)增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機(jī)構(gòu)。