您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品分類品牌分類
-
混勻儀|混合器 氣體發(fā)生器 分光測色計 勻漿機(jī) 研磨機(jī) 超凈工作臺 洗板機(jī) 高低溫試驗(yàn)箱 恒溫金屬浴 電阻爐 溶劑過濾器 漩渦混合儀|旋渦混勻儀 均質(zhì)器 水槽 恒溫水槽 手套 培養(yǎng)板 生物安全柜 天平 滴定管 瓶口分液器 光澤儀 錐入度儀 濁度計 分析儀 冷藏保存箱 色差儀 超純水機(jī) 預(yù)制冷槽 油浴槽 冷卻水循環(huán)裝置 溶媒回收裝置 恒溫水浴槽 液氮罐 馬弗爐 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 電泳儀 潔凈工作臺 干燥箱 磁力攪拌器 滅菌器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 低溫冰箱 防爆冰箱 離心機(jī) 振蕩器 移液器 真空泵
熒光定量pcr儀定量方法之-定量
在做qPCR實(shí)驗(yàn)時，我們經(jīng)常會問：“你是做定量還是相對定量呢？”，而定量方法的選擇是取決于實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)。定量可測定目標(biāo)核酸分子的實(shí)際拷貝數(shù)，但也是費(fèi)力、復(fù)雜的定量形式。此方法要求周密的實(shí)驗(yàn)方案和高度準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用于確定病毒滴度。
使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量
定量是通過樣品的Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)的。首先為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定其拷貝數(shù)濃度。
從圖1可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板起始濃度越大時，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數(shù)Cq值呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。
如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品？
如前所述，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的模板將決定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。所以使用與實(shí)驗(yàn)樣本盡可能類似的目標(biāo)模板，可優(yōu)選有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)。那么制備標(biāo)準(zhǔn)品的常見方法如下：
? DNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段或含有目的靶點(diǎn)的質(zhì)?？寺。▓D2）。
優(yōu)點(diǎn)：易于生成、定量，可在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下維持穩(wěn)定性。
缺點(diǎn)：無法進(jìn)行qRT-PCR 的逆轉(zhuǎn)錄步驟，大大影響了反應(yīng)效率。
PCR擴(kuò)增片段：通過常規(guī)PCR進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，回收純化PCR擴(kuò)增片段，可直接作為標(biāo)準(zhǔn)品，相對于質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增片段不是那么穩(wěn)定。
質(zhì)?？寺。簩⒛康钠芜M(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶后連入T載體，再進(jìn)行質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。
? RNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點(diǎn)的體外轉(zhuǎn)錄RNA(圖3)
優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合了RT效率，程度地模擬了目的靶點(diǎn)。
缺點(diǎn)：需要耗費(fèi)時間生成該標(biāo)準(zhǔn)品，因其不穩(wěn)定，難以保持長期準(zhǔn)確度。
體外轉(zhuǎn)錄RNA：利用實(shí)時熒光定量PCR生成的PCR 產(chǎn)物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉(zhuǎn)錄引物重新擴(kuò)增。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準(zhǔn)確定量并稀釋，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Azure Cielo™實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)——定量示例
•方法:從組織中提取基因組DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測
•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)