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知曉PCR，定量PCR與數(shù)字PCR的實(shí)驗(yàn)方法與選擇

閱讀：1543 發(fā)布時(shí)間：2021-1-9

從1985年至今的30多年時(shí)間里，PCR分析經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。一代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。第二代熒光定量PCR技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程，后用Cq值對基因進(jìn)行定量分析。第三代數(shù)字PCR技術(shù)，通過將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋，實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，終采取終點(diǎn)法檢測陽性微滴的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為 1；沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。

PCR技術(shù)在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經(jīng)滲透到分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術(shù)的強(qiáng)大之處。那在科學(xué)研究中，我們該如何選擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術(shù)所有的基礎(chǔ)源于PCR反應(yīng)的基本原理和PCR反應(yīng)的3個(gè)重要階段，分別是指數(shù)期、線性期和平臺(tái)期。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應(yīng)效率），該階段的擴(kuò)增反應(yīng)具有高度特異性和精度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系成分的消耗，其中的一個(gè)或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺(tái)期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期內(nèi)可以看到這些差異。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個(gè)反應(yīng)孔含有相同量的 DNA模板，但到達(dá)平臺(tái)期后產(chǎn)生的熒光信號(hào)卻不同，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的量存在不同（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化所致）。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺(tái)期測量時(shí)結(jié)果存在變異，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映初情況，所以無法進(jìn)行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個(gè)反應(yīng)孔的擴(kuò)增曲線*重合，說明指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行檢測將更加確，可實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量。閾值線是擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度超過背景時(shí)的一個(gè)熒光強(qiáng)度值，樣品達(dá)到此熒光強(qiáng)度值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值，可以測定未知反應(yīng)中的模板 DNA數(shù)量。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過將樣本DNA隨機(jī)分布至獨(dú)立的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，所有獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴(kuò)增后，對每個(gè)反應(yīng)單元的陰性或者陽性熒光信號(hào)進(jìn)行檢測并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，就可以計(jì)算出原始樣本的拷貝數(shù)，無需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對照品，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。