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定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性

閱讀:1932        發(fā)布時(shí)間:2021-1-21

熒光定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性  在選購熒光定量PCR儀時(shí),幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)要注意:
   1.儀器的檢測通量(Throughput)
    首先要考慮實(shí)驗(yàn)室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示,如果不是大規(guī)模批量使用,比如說主要是用來檢測驗(yàn)已知基因,那確實(shí)不需要昂貴的端產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室,就需要能容納384孔板、運(yùn)行時(shí)間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的,你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實(shí)驗(yàn)室往往需要進(jìn)一步的自動化儀器,只要“按一下鈕”,儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
 
   2.多重?cái)U(kuò)增的能力 
    多重?cái)U(kuò)增越來越熱。實(shí)時(shí)定量PCR儀也不能幸免。端定量PCR儀擁有多個(gè)檢測通道,因而儀器就可以檢測同一個(gè)樣品槽里多個(gè)模板的擴(kuò)增過程。新的LightCycler2.0 有6個(gè)檢測通道,比原來多了3個(gè)。SmartCyclerⅡ有4個(gè)檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價(jià)格不到Roche的一半、口碑不錯(cuò)的定量PCR儀Mx3000P,也就是4個(gè)檢測通道。不過多重?cái)U(kuò)增并非人人適用,因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。
 
  3.軟件 
     當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺定量PCR儀,你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎,是否可以進(jìn)行你所需要的分析,輸出格式有幾種。不過,你需要留意,太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進(jìn)行復(fù)雜計(jì)算,以前的軟件還需要你做進(jìn)一步分析,新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能,部分軟件還可以有更多的功能,比如引物和探針設(shè)計(jì)、多重分析設(shè)計(jì)、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強(qiáng)調(diào):定量PCR是一個(gè)幾何擴(kuò)增的過程,開始時(shí)一個(gè)拷貝之差,結(jié)果就有幾何數(shù)量級之別。
 
    4.靈活性 
    大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備*固然令人羨慕,常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室同樣可以有精彩的選擇?,F(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家,不單了解你的目前需要,還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化,比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實(shí)時(shí)定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽,可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實(shí)驗(yàn)室來說,SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個(gè)好選擇,一個(gè)基本模塊有16個(gè)獨(dú)立控溫樣品槽,可以同時(shí)或者前后分別進(jìn)行16個(gè)*獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn), “隨機(jī)存取”;當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要較大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí),可以非常經(jīng)濟(jì)地升級,從1個(gè)增加到6個(gè)基本模塊,也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板,但是當(dāng)一個(gè)學(xué)生開始小量實(shí)驗(yàn),其他人還可以隨時(shí)插進(jìn)去開始自己的獨(dú)立實(shí)驗(yàn),而且互不干擾,就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實(shí)驗(yàn)而且預(yù)算較緊張的實(shí)驗(yàn)室來說是非常靈活的選擇。
 
    5.不確定性 
   盡管軟件可以做部分修正,購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器,無需那么多計(jì)算修正總比靠計(jì)算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為,要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異,還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試,他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。很不幸,很多時(shí)候,不同樣品孔之間會有不同的結(jié)果。
 
    6.試劑盒的選擇 
    盡管銷售人員會吹噓有出色質(zhì)量控制的試劑盒和解決方案就會得到一至的結(jié)果,但購買現(xiàn)成的試劑盒并不是解決差異性的辦法。認(rèn)真的評估實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)才是解決之道。

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