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新手須知的qPCR操作技巧

閱讀:2375        發(fā)布時(shí)間:2022-5-1

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)自問(wèn)世以來(lái),就受到了廣大生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)工作者和醫(yī)院檢驗(yàn)工作者的極大關(guān)注,使得該技術(shù)得到了很快的普及。雖然qPCR技術(shù)目前應(yīng)用方向十分廣泛,但是仍碰到很多用戶在實(shí)驗(yàn)中存在著由于不當(dāng)操作而數(shù)據(jù)精度不高、重復(fù)性差、可信度差等問(wèn)題。在這里,我們根據(jù)實(shí)際工作中的經(jīng)驗(yàn)以及參考萬(wàn)謙等人[1]的研究,給大家詳細(xì)說(shuō)明一些有助于提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的操作技巧,希望能給大家?guī)?lái)一定的幫助。
 

1、引物的操作技巧:

使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí),在操作界面上設(shè)定相應(yīng)的參數(shù),擴(kuò)增子參數(shù)一般設(shè)定范圍為80 ~ 200bp,擴(kuò)增子長(zhǎng)度越短,擴(kuò)增效率越高,可選擇設(shè)定在110bp,110bp在后期的擴(kuò)增中僅用10s,其余的參數(shù)均默認(rèn),軟件即給出引物列表,一般選用評(píng)分高或者靠前的,因?yàn)樵u(píng)分越高或越靠前的引物對(duì)形成引物二聚體的可能越小。
 

引物一般由試劑公司合成,為干粉狀態(tài),在溶解前,最好用高速離心機(jī)低溫快速離心30s,使得引物干粉匯聚到管底,避免損失引物。引物收到后,需要先摸索引物的退火溫度和終濃度,以達(dá)到較理想的qPCR擴(kuò)增效果,其次測(cè)定引物的擴(kuò)增效率,通常在非正式實(shí)驗(yàn)時(shí),假定引物的擴(kuò)增效率為*,擴(kuò)增產(chǎn)物在指數(shù)期呈現(xiàn)2n的增長(zhǎng)。在正式實(shí)驗(yàn)時(shí),考慮到引物的擴(kuò)增效率實(shí)際不是100%,所以需要測(cè)定引物的擴(kuò)增效率以修正結(jié)果。一個(gè)測(cè)定引物擴(kuò)增效率的簡(jiǎn)單方法如下: 以cDNA樣品或標(biāo)準(zhǔn)品為模板,依次稀釋 101、102、103、104、105、106 倍,采用前期摸索好的qPCR擴(kuò)增條件,得到6個(gè)Cq值,然后以log(模板濃度)為X軸變量,以Cq值為Y軸變量作回歸直線圖,得到直線的斜率,擴(kuò)增效率 = 10( -1 /斜率) - 1,整個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算可以在Excel中完成,也可在qPCR軟件中直接得出。
 

2、反應(yīng)體系配制技巧:

正式實(shí)驗(yàn)時(shí),每個(gè)樣本至少3個(gè)重復(fù),為了消除各重復(fù)之間的系統(tǒng)誤差,可配置3.2個(gè)反應(yīng)體系,將所需的所有試劑和模板加在同一個(gè)PCR管中,充分渦旋混勻后,再分裝到3個(gè)重復(fù)孔中,這樣可有效減小系統(tǒng)誤差。另外,一些實(shí)驗(yàn)者為了節(jié)省試劑,采用10μL反應(yīng)體系,我們認(rèn)為這是不可取的,因?yàn)轶w積太小,加樣誤差會(huì)大,這樣做得不償失,建議使用20μL以上的反應(yīng)體積。如上操作,可以在較大程度上消除由于加樣不準(zhǔn)造成的系統(tǒng)誤差。
 

如表1所列,“優(yōu)化前”是5管中分別依次加入模板和各反應(yīng)試劑,最后得到的Cq值標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.66;“優(yōu)化后”是使用模板和各反應(yīng)試劑的混合液,然后分裝至5管中,最后得到的Cq值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 32;由上述可見,數(shù)據(jù)精度得到極大的改善。

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