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pcr電泳條帶圖的解讀方法
pcr電泳條帶圖的解讀方法的探究 首先要從PCR的擴(kuò)增原理說(shuō)起：今天小編為您分析歸納，希望對(duì)您有用
PCR的原理：PCR的基本過程類似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的Oligo引物。整個(gè)過程由變性-退火-延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1，模板DNA變性：模板或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，雙鏈之間氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下一輪反應(yīng)做準(zhǔn)備。
2，模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：DNA加熱變性成單鏈后，當(dāng)溫度降至一定程度（55℃左右）時(shí)，引物即與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。
3，引物的延伸（72℃）：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP為原料，按A-T、C-G堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。
重復(fù)上述 變性-退火-延伸 的循環(huán)過程，每一循環(huán)獲得的“半保留復(fù)制鏈"都可成為下次循環(huán)的模板。通常每完成一個(gè)循環(huán)需時(shí)為2~4min，2~3h就能將靶核酸擴(kuò)增放大上億倍（30個(gè)循環(huán)時(shí)，靶產(chǎn)物數(shù)量約為10億）。（注：PCR的第1和第2個(gè)循環(huán)，并沒有短的目的片段，只是在第3個(gè)循環(huán)后才有，并且有部分雙鏈的長(zhǎng)片段將始終伴隨整個(gè)擴(kuò)增過程）
下面結(jié)合具體事例分析
PCR電泳法應(yīng)用實(shí)例介紹
比如現(xiàn)在有一名高血壓患者，我現(xiàn)在要做高血壓個(gè)性化用藥基因檢測(cè)（點(diǎn)擊查看），擬選擇卡托普利進(jìn)行降壓，那么需要對(duì)ACE I/D突變進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過引物設(shè)計(jì)（點(diǎn)擊查看），最終的野生型目的片段約在200bp左右，由于突變型的目的片段比野生型的多了287bp的插入，那么突變型的片段約在500bp左右。
ACE I/D 16號(hào)內(nèi)含子中存在的287bp插入
DNA經(jīng)過PCR的擴(kuò)增后，我們對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，DNA凝膠電泳所需的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖濃度一般為1.0%。濃度越高，小條帶的分辨率越高；反之，瓊脂糖濃度越低，大分子量條帶的分辨率和分離程度越高。
在電場(chǎng)中，中性pH值緩沖液（TAE/TBE）下DNA都帶凈負(fù)電荷并向凝膠裝置正極(+)方向移動(dòng)（下圖中，上為“-極"至下為“+極"），DNA分子越大則所受阻力越大，也越難在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢，比如500bp的DNA分子比200bp的DNA分子遷移就慢。
此外，電泳時(shí)需要將DNA與熒光染料混勻，結(jié)合染料后，DNA會(huì)在紫外燈下發(fā)出熒光，這樣才會(huì)出現(xiàn)下圖中的亮色條帶，常用的染料有EB（溴化乙啶）、gel red、sybrgreen1等（有錢建議不要用EB，因?yàn)橛卸荆?br/>
在電泳結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果解讀，我們無(wú)法直接判斷DNA的長(zhǎng)度，所以需要在電泳過程將DNA產(chǎn)物與DNA標(biāo)準(zhǔn)品（DNA Marker）一起跑電泳，DNA Marker里面含有若干種長(zhǎng)度已知的DNA（下圖中出現(xiàn)6條亮帶的就是DNA Marker），通過與之比較可以粗略判斷DNA樣品的長(zhǎng)度。同時(shí)DNA Marker中的DNA片段濃度已知，通過與DNA Marker的亮度進(jìn)行比較也能初步判斷DNA樣品的濃度。
結(jié)果解讀：通過與DNA Marker比較，如果是野生型，那么就是左邊這個(gè)圖，可發(fā)現(xiàn)DNA片段長(zhǎng)度大小約為200bp，如果是突變型，那么就是右邊這個(gè)圖，突變有純合突變和雜合突變兩種，中間一條500bp的條帶即為純合突變，最右邊的200bp及500bp兩條條帶即為雜合突變，通過PCR及簡(jiǎn)單的電泳法便可準(zhǔn)確的進(jìn)行ACE I/D的檢測(cè)。