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多功能酶標(biāo)儀的應(yīng)用介紹及選型
酶標(biāo)儀也被稱為微孔板檢測(cè)儀，是生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的重要工具。
傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀是指具備吸收光檢測(cè)功能的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，后來隨著檢測(cè)方式的發(fā)展，在吸收光檢測(cè)基礎(chǔ)上增加了熒光和發(fā)光檢測(cè)，因此，我們把具有兩種及兩種以上檢測(cè)功能的酶標(biāo)儀稱為多功能酶標(biāo)儀，也叫做多功能微孔板檢測(cè)儀，目前廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)研究中。
十年技術(shù)支持的經(jīng)驗(yàn)來簡(jiǎn)單粗暴地談一談多功能酶標(biāo)儀以及它能實(shí)現(xiàn)的功能，希望能為研究者在選擇酶標(biāo)儀的時(shí)候提供一定的參考。
多功能酶標(biāo)儀的應(yīng)用
多功能酶標(biāo)儀通常包括紫外-可見吸收光、熒光強(qiáng)度及發(fā)光三種檢測(cè)模式，熒光檢測(cè)還包括高級(jí)熒光應(yīng)用。因此一臺(tái)全面的多功能酶標(biāo)儀能夠提供的檢測(cè)模式可以包括：
1、吸收光檢測(cè)（Absorbance）：
使用單色器或者濾光片系統(tǒng)來發(fā)射和檢測(cè)特定波長(zhǎng)，檢測(cè)的是物質(zhì)本身，不同的物質(zhì)有不同的吸收光波長(zhǎng)，對(duì)波長(zhǎng)選擇靈活性要求較高。
典型應(yīng)用：ELISA 以及 DNA/RNA 純度檢測(cè)
2、熒光強(qiáng)度（Fluorescence Intensity，F(xiàn)I）：
采用特定波長(zhǎng)激發(fā)光來激發(fā)樣品孔內(nèi)的熒光標(biāo)志物，通過檢測(cè)器檢測(cè)熒光物質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)生光。因?yàn)闊晒夥肿颖患ぐl(fā)后電子會(huì)發(fā)生能量躍遷，當(dāng)電子回落時(shí)產(chǎn)生發(fā)射光，因此發(fā)射光的波長(zhǎng)會(huì)比激發(fā)光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)（能量更低），比如常用的 GFP 的最佳激發(fā)波長(zhǎng)是 488nm ，最佳發(fā)射光檢測(cè)波長(zhǎng)是 510nm 。
熒光強(qiáng)度還有一個(gè)衍生實(shí)驗(yàn)，那就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET），使用兩種熒光分子分別作為供體和受體去標(biāo)記兩個(gè)生物分子，如果兩個(gè)生物分子足夠接近，那么供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體熒光分子發(fā)出熒光信號(hào)。FRET 通常用來檢測(cè)生物大分子相互作用。值得注意的是，選用的供體熒光分子發(fā)射光波長(zhǎng)范圍需要與受體熒光分子的激發(fā)光波長(zhǎng)重疊。
3、發(fā)光檢測(cè)（Luminescence）：
包括化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光，是樣本孔內(nèi)發(fā)生的化學(xué)、生化或者酶反應(yīng)發(fā)出的光信號(hào)。與吸收光和熒光檢測(cè)不同的是，發(fā)光檢測(cè)不需要激發(fā)光源，這就使得發(fā)光更敏感，更不容易引起背景噪音。
典型應(yīng)用：ATP 檢測(cè)和雙報(bào)告基因檢測(cè)
4、發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）：跟 FRET 類似的檢測(cè)原理，不同的是供體產(chǎn)生生物發(fā)光來激發(fā)受體熒光分子，可以用來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的分子互作分析。
5、時(shí)間分辨熒光（Time-resolved fluorescence ，TRF）：
是一種高級(jí)熒光檢測(cè)，使用鑭系金屬（常用稀土元素：銪 Eu 和鋱 Tb）做熒光標(biāo)記，這種稀土元素的特點(diǎn)是：被激發(fā)后熒光壽命很長(zhǎng)，不會(huì)馬上猝滅。利用這種特性，就可以在激發(fā)后延遲檢測(cè)，使得檢測(cè)信號(hào)不受激發(fā)光和背景熒光的干擾，是一種極其敏感的檢測(cè)方法。
這種方法常常與能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）聯(lián)合使用，也就是大家熟知的 HTRF 技術(shù)（勻相時(shí)間分辨熒光），用于大分子相互作用檢測(cè)，靈敏度高、特異性好。
6、熒光偏振（Fluorescence polarization，F(xiàn)P）：
也是一種高級(jí)熒光檢測(cè)模式，需要酶標(biāo)儀產(chǎn)生的激發(fā)光光波能夠在一個(gè)方向上振蕩，熒光標(biāo)記在小分子上，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來檢測(cè)大分子和小分子相互作用，了解熒光偏振技術(shù)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案。
7、Alpha:
AlphaScreen® 和 AlphaLISA® 是以微珠為基礎(chǔ)的勻相發(fā)光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。供體微珠和受體微珠可以通過各種各樣的生物分子結(jié)合在一起——只要他們結(jié)合在一起，供體微珠被 680nm 光源激發(fā)后會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)放大的信號(hào)，并擴(kuò)散到受體微珠，使受體微珠產(chǎn)生一個(gè)發(fā)射光。常用于檢測(cè)大分子相互作用。AlphaPlex™ 是 AlphaScreen® 的變體,可以促進(jìn)多達(dá)三種分析物的量化。
多功能酶標(biāo)儀的應(yīng)用概覽
檢測(cè)模式 | 應(yīng)用 |
吸收光檢測(cè) | 核酸純度/定量、蛋白質(zhì)定量、ELISA、細(xì)菌生長(zhǎng) OD600 測(cè)定、MMT/CCK8 等細(xì)胞活力分析 |
熒光強(qiáng)度 | DNA/RNA 準(zhǔn)確定量、蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞定量、基于熒光的免疫吸附測(cè)定、酶動(dòng)力學(xué)、鈣流檢測(cè)、線粒體膜電位 |
發(fā)光檢測(cè) | 報(bào)告基因分析、鈣流、化學(xué)發(fā)光 ELISA、BRET、細(xì)胞活力分析(ATP)、細(xì)胞毒性、激酶分析 |
時(shí)間分辨熒光(TRF)/勻相時(shí)間分辨熒光(HTRF) | GPCR 測(cè)定、激酶測(cè)定、細(xì)胞因子和生物標(biāo)志物檢測(cè)、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、藥物發(fā)現(xiàn)、高通量篩選 |
熒光偏振(FP) | 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-小分子藥物相互作用、蛋白 -DNA 相互作用 |
Alpha 檢測(cè) | GPCR 測(cè)定、激酶測(cè)定、細(xì)胞因子定量、生物標(biāo)志物檢測(cè)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、藥物發(fā)現(xiàn)、高通量篩選 |