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蛋白質(zhì)濃度測定方法
蛋白質(zhì)是細(xì)胞中最重要的含氮生物大分子之一，承擔(dān)著各種生物功能。蛋白質(zhì)的定量分析是蛋白質(zhì)構(gòu)造分析的基礎(chǔ)。目前常用的蛋白測量的方法主要有BCA法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)和Lowry法等。
BCA法
原理
在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+(biuret reaction)。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.按試劑盒說明書配置BCA工作液；
2.完溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說明書要求對標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入BCA工作液，用酶標(biāo)儀測定其吸光度；
3.以樣品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4.待測樣品中加入BCA工作液，測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。
與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)法
原理
考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.按試劑盒說明書配置Bradford染液；
2.溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說明書要求對標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入染液和染料結(jié)合液后，用酶標(biāo)儀測定其吸光度；
3.以標(biāo)品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4.各孔中加入染液和染料結(jié)合液，測定樣品吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。
Bradford法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質(zhì)。
斐林—酚試劑(Lowry)法
原理
斐林(Folin)-酚試劑法結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物;第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)，在650nm波長下有最大光吸收。
實(shí)驗(yàn)步驟
與上述兩種方法大致相同
LORRY法靈敏度高,重復(fù)性好，適于5～l00μg蛋白質(zhì)的定量，耗時(shí)長，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中要特別注意排除還原物質(zhì)、檸檬酸等的干擾作用才能得到最準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
這幾種方法共同點(diǎn)在于，都需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品往往數(shù)量較多，為了縮短實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，保證測量準(zhǔn)確性，可使用酶標(biāo)儀對吸光度進(jìn)行測定。