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抗體標(biāo)記直接法和間接法的選用

2012-2-10  閱讀(7267)

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    很多免疫學(xué)技術(shù)依賴于標(biāo)記抗體的使用。對抗體進(jìn)行標(biāo)記主要是用于抗原的定位分析,在某些情況下,也可以對混雜有大量其他分子的樣本中的抗原進(jìn)行定量檢測。由于抗體與其相應(yīng)抗原具有很高的親和力,因此帶有易識別標(biāo)記物的抗體可以定位分析抗原,并且是一種理想的快速價廉的定量測定方法。需要使用標(biāo)記抗體的三種方法,即免疫染色法、免疫印跡法和免疫分析。此三種方法均能定位復(fù)雜混合物中的抗原,而且通過適當(dāng)?shù)膶φ找材芏繙y定。就免疫染色法而言,其目的就是定位正常細(xì)胞環(huán)境中出現(xiàn)的抗原。在此背景下,所有抗原均暴露于抗體,而抗體只和相應(yīng)的抗原結(jié)合,標(biāo)記后的抗體則能夠準(zhǔn)確定位抗原。免疫印跡法是將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)過變性和凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移至膜上,然后利用標(biāo)記抗體即能從一系列蛋白區(qū)帶中檢出所要研究的抗原。免疫分析則是利用各種方法顯示或捕獲抗原,然后用標(biāo)記抗體進(jìn)行定位和定量分析。上述技術(shù)均依賴于標(biāo)記抗體來定位抗原。
    當(dāng)準(zhǔn)備采用這些方法時,首先應(yīng)確定利用直接法還是間接法來定位抗原以及選用何砷標(biāo)記物該項技術(shù)的要求。下面將討論這兩個問題。
    檢測技術(shù)可分為兩大類即直接法和間接法。直接法是將抗體經(jīng)過純化,再用一種易于識別的示蹤劑標(biāo)記,然后使其直接與抗原結(jié)合,通過檢測抗體上的標(biāo)記物來測定相應(yīng)抗原。在間接法中,抗體既不用標(biāo)記也無須純化,當(dāng)其與抗原結(jié)合后經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗體,再通過二的試劑如標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或蛋白A、蛋白G等來檢測抗原抗體復(fù)合物。在上述過程中,與抗原結(jié)合的抗體稱為*抗體(簡稱一抗),當(dāng)其用于直接法時經(jīng)過標(biāo)記,而在間接法中則未標(biāo)記;與一抗結(jié)合的抗體稱為第二抗體(簡稱二抗),在間接法中常被標(biāo)記。
直接與間接檢測法
   直接法或間接法的選用取決于實驗條件。在直接檢測法中應(yīng)用標(biāo)記的一抗可減少操作步驟,且不易出現(xiàn)背景問題,但敏感性低于間接法,而且所用的每一種抗體都必須分別進(jìn)行標(biāo)記。反之,間接法敏感性高、標(biāo)記物的應(yīng)用范圍廣,且一抗未經(jīng)標(biāo)記,故可避免其活性下降。因此,多數(shù)情況下用間接法。
直接法和間接法的選用

檢測方法
直接法
間接法
標(biāo)記位置
標(biāo)記一抗
標(biāo)記二抗
優(yōu)點
檢測步驟較少,背景低
敏感性高,標(biāo)記物應(yīng)用范圍廣、一抗無需標(biāo)記,較易掌握
缺點
敏感性偏低,每一種抗體均需分別標(biāo)記較難掌握
背景較高

    當(dāng)使用標(biāo)記二抗時,無須自己制備標(biāo)記反應(yīng)試劑,可從許多廠商購買。有關(guān)試劑可大批量制備并經(jīng)過檢定,經(jīng)濟(jì)實用。因此只要有可能,推薦使用間接法和商品化試劑。
    有時,必須使用直接標(biāo)記的抗體。zui常見的情況是共定位研究,即需要在同一細(xì)胞或組織標(biāo)本中定位分析兩種或多種抗原。在這種情況下,每一抗體都需經(jīng)過純化并標(biāo)記不同的示蹤物,以便對相應(yīng)抗原的位置做出對比。此外,當(dāng)背景因素影響結(jié)果時,使用標(biāo)記的一抗是行之有效的方法。zui后,在免疫分析中,必須使用標(biāo)記的一抗才能得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。  

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