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很多免疫學(xué)技術(shù)依賴于標記抗體的使用。對抗體進行標記主要是用于抗原的定位分析，在某些情況下，也可以對混雜有大量其他分子的樣本中的抗原進行定量檢測。由于抗體與其相應(yīng)抗原具有很高的親和力，因此帶有易識別標記物的抗體可以定位分析抗原，并且是一種理想的快速價廉的定量測定方法。需要使用標記抗體的三種方法，即免疫染色法、免疫印跡法和免疫分析。此三種方法均能定位復(fù)雜混合物中的抗原，而且通過適當?shù)膶φ找材芏繙y定。就免疫染色法而言，其目的就是定位正常細胞環(huán)境中出現(xiàn)的抗原。在此背景下，所有抗原均暴露于抗體，而抗體只和相應(yīng)的抗原結(jié)合，標記后的抗體則能夠準確定位抗原。免疫印跡法是將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)過變性和凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至膜上，然后利用標記抗體即能從一系列蛋白區(qū)帶中檢出所要研究的抗原。免疫分析則是利用各種方法顯示或捕獲抗原，然后用標記抗體進行定位和定量分析。上述技術(shù)均依賴于標記抗體來定位抗原。
當準備采用這些方法時，首先應(yīng)確定利用直接法還是間接法來定位抗原以及選用何砷標記物該項技術(shù)的要求。下面將討論這兩個問題。
檢測技術(shù)可分為兩大類即直接法和間接法。直接法是將抗體經(jīng)過純化，再用一種易于識別的示蹤劑標記，然后使其直接與抗原結(jié)合，通過檢測抗體上的標記物來測定相應(yīng)抗原。在間接法中，抗體既不用標記也無須純化，當其與抗原結(jié)合后經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗體，再通過二的試劑如標記的抗免疫球蛋白抗體或蛋白A、蛋白G等來檢測抗原抗體復(fù)合物。在上述過程中，與抗原結(jié)合的抗體稱為*抗體(簡稱一抗)，當其用于直接法時經(jīng)過標記，而在間接法中則未標記；與一抗結(jié)合的抗體稱為第二抗體(簡稱二抗)，在間接法中常被標記。
直接與間接檢測法
直接法或間接法的選用取決于實驗條件。在直接檢測法中應(yīng)用標記的一抗可減少操作步驟，且不易出現(xiàn)背景問題，但敏感性低于間接法，而且所用的每一種抗體都必須分別進行標記。反之，間接法敏感性高、標記物的應(yīng)用范圍廣，且一抗未經(jīng)標記，故可避免其活性下降。因此，多數(shù)情況下用間接法。
直接法和間接法的選用
| 檢測方法 | 直接法 | 間接法 |
| 標記位置 | 標記一抗 | 標記二抗 |
| 優(yōu)點 | 檢測步驟較少，背景低 | 敏感性高，標記物應(yīng)用范圍廣、一抗無需標記，較易掌握 |
| 缺點 | 敏感性偏低，每一種抗體均需分別標記較難掌握 | 背景較高 |
當使用標記二抗時，無須自己制備標記反應(yīng)試劑，可從許多廠商購買。有關(guān)試劑可大批量制備并經(jīng)過檢定，經(jīng)濟實用。因此只要有可能，推薦使用間接法和商品化試劑。
有時，必須使用直接標記的抗體。zui常見的情況是共定位研究，即需要在同一細胞或組織標本中定位分析兩種或多種抗原。在這種情況下，每一抗體都需經(jīng)過純化并標記不同的示蹤物，以便對相應(yīng)抗原的位置做出對比。此外，當背景因素影響結(jié)果時，使用標記的一抗是行之有效的方法。zui后，在免疫分析中，必須使用標記的一抗才能得到準確的檢測結(jié)果。
