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很多免疫學(xué)技術(shù)依賴于標(biāo)記抗體的使用。對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記主要是用于抗原的定位分析，在某些情況下，也可以對(duì)混雜有大量其他分子的樣本中的抗原進(jìn)行定量檢測。由于抗體與其相應(yīng)抗原具有很高的親和力，因此帶有易識(shí)別標(biāo)記物的抗體可以定位分析抗原，并且是一種理想的快速價(jià)廉的定量測定方法。需要使用標(biāo)記抗體的三種方法，即免疫染色法、免疫印跡法和免疫分析。此三種方法均能定位復(fù)雜混合物中的抗原，而且通過適當(dāng)?shù)膶?duì)照也能定量測定。就免疫染色法而言，其目的就是定位正常細(xì)胞環(huán)境中出現(xiàn)的抗原。在此背景下，所有抗原均暴露于抗體，而抗體只和相應(yīng)的抗原結(jié)合，標(biāo)記后的抗體則能夠準(zhǔn)確定位抗原。免疫印跡法是將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)過變性和凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至膜上，然后利用標(biāo)記抗體即能從一系列蛋白區(qū)帶中檢出所要研究的抗原。免疫分析則是利用各種方法顯示或捕獲抗原，然后用標(biāo)記抗體進(jìn)行定位和定量分析。上述技術(shù)均依賴于標(biāo)記抗體來定位抗原。
當(dāng)準(zhǔn)備采用這些方法時(shí)，首先應(yīng)確定利用直接法還是間接法來定位抗原以及選用何砷標(biāo)記物該項(xiàng)技術(shù)的要求。下面將討論這兩個(gè)問題。
檢測技術(shù)可分為兩大類即直接法和間接法。直接法是將抗體經(jīng)過純化，再用一種易于識(shí)別的示蹤劑標(biāo)記，然后使其直接與抗原結(jié)合，通過檢測抗體上的標(biāo)記物來測定相應(yīng)抗原。在間接法中，抗體既不用標(biāo)記也無須純化，當(dāng)其與抗原結(jié)合后經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗體，再通過二的試劑如標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或蛋白A、蛋白G等來檢測抗原抗體復(fù)合物。在上述過程中，與抗原結(jié)合的抗體稱為*抗體(簡稱一抗)，當(dāng)其用于直接法時(shí)經(jīng)過標(biāo)記，而在間接法中則未標(biāo)記；與一抗結(jié)合的抗體稱為第二抗體(簡稱二抗)，在間接法中常被標(biāo)記。
直接與間接檢測法
直接法或間接法的選用取決于實(shí)驗(yàn)條件。在直接檢測法中應(yīng)用標(biāo)記的一抗可減少操作步驟，且不易出現(xiàn)背景問題，但敏感性低于間接法，而且所用的每一種抗體都必須分別進(jìn)行標(biāo)記。反之，間接法敏感性高、標(biāo)記物的應(yīng)用范圍廣，且一抗未經(jīng)標(biāo)記，故可避免其活性下降。因此，多數(shù)情況下用間接法。
直接法和間接法的選用
| 檢測方法 | 直接法 | 間接法 |
| 標(biāo)記位置 | 標(biāo)記一抗 | 標(biāo)記二抗 |
| 優(yōu)點(diǎn) | 檢測步驟較少，背景低 | 敏感性高，標(biāo)記物應(yīng)用范圍廣、一抗無需標(biāo)記，較易掌握 |
| 缺點(diǎn) | 敏感性偏低，每一種抗體均需分別標(biāo)記較難掌握 | 背景較高 |
當(dāng)使用標(biāo)記二抗時(shí)，無須自己制備標(biāo)記反應(yīng)試劑，可從許多廠商購買。有關(guān)試劑可大批量制備并經(jīng)過檢定，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。因此只要有可能，推薦使用間接法和商品化試劑。
有時(shí)，必須使用直接標(biāo)記的抗體。zui常見的情況是共定位研究，即需要在同一細(xì)胞或組織標(biāo)本中定位分析兩種或多種抗原。在這種情況下，每一抗體都需經(jīng)過純化并標(biāo)記不同的示蹤物，以便對(duì)相應(yīng)抗原的位置做出對(duì)比。此外，當(dāng)背景因素影響結(jié)果時(shí)，使用標(biāo)記的一抗是行之有效的方法。zui后，在免疫分析中，必須使用標(biāo)記的一抗才能得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
