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PCR實驗操作

2012-7-16  閱讀(1597)

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PCR實驗操作
 
    PCR是極為重要的DNA增殖技術(shù),應(yīng)用層面非常廣,其中包括了核酸探針的制備。如果一段DNA已經(jīng)被次選殖至載體上,要以PCR擴增這段DNA時,可根據(jù)質(zhì)體multiple cloning sites兩邊的序列,選用適當(dāng)?shù)暮怂嵋?(universal primers) 進行擴增反應(yīng);比較常用的引子包括SP6, T3 與T7 promoter primer, M13/pUCforward與reverse primers等;若有特殊考量,也可以使用序列專一性核酸引子對。進行PCR反應(yīng)時若同時添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所標(biāo)定,所以PCR是制備核酸探針非常便捷好用的方法。
 
    儀器用具:微量離心機;PCR 反應(yīng)器
 
    藥品試劑:
    模版DNA: pBlueGus 質(zhì)體DNA (~50 pg)
    核酸引子對: T3 promoter primer 與T7 promoter primer (各2 μM)
    礦物油 (是否需要視PCR反應(yīng)器機型而定)
    PCR DIG probe synthesis kit (Roche), 內(nèi)含:
    Taq DNA polymerase (Expand High Fidelity, 3.5 U/μL)
    10×PCR DIG probe synthesis mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0)
    Expand high fidelity buffer with MgCl2 (10×)
 
    方法步驟:
    以下反應(yīng)條件主要參照PCR DIG probe synthesis kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說明。
    1)  取一支0.5 mL微量離心管,依下表逐一加入各項試劑 (單位 μL):
  
    2) 以手指頭輕彈管壁使各項試劑混合均勻。
    3) 短暫離心后,徐徐加入100 μL 礦物油。
    ◆ 有些PCR 反應(yīng)器不需使用礦物油。
    4) 在PCR 反應(yīng)器上設(shè)定PCR 反應(yīng)條件:Denaturation: 94℃/10 min
    擴增反應(yīng):
     30 循環(huán)的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]
    zui后的elongation step:72℃/10 min
    5) 將微量離心管移至反應(yīng)器上,并開始進行PCR 反應(yīng)。
    6) 反應(yīng)完成后,以微量移液器吸出礦物油,并取出5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物,進行洋菜膠體電泳分析。

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