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肉毒梭菌診斷技術(shù)

2012-9-7  閱讀(2129)

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疾病診斷、細(xì)菌鑒定,關(guān)鍵在鑒定毒素。從材料中如能迅速檢出毒素為,檢出速度快,治療預(yù)防能及時。從癥狀、流行病學(xué)懷疑肉毒癥后,應(yīng)先千方百計地在極短時期內(nèi)證明檢材中是否有肉毒梭菌毒素,搶時間救人。在設(shè)法證明毒素存在的同時,進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定及產(chǎn)毒能力測定。

 
   (1)檢驗程序  檢驗菌株是否產(chǎn)生肉毒毒素,或污染食品中是否有產(chǎn)毒素的肉毒梭菌存可按圖進(jìn)行檢驗。
 
檢樣接種肝湯35℃培養(yǎng)3天    檢樣接種TPCYT肉湯2℃培養(yǎng)5天
↓                       ↓
取液體部分7000r/min離心30min
取上清中過滅菌
↓              ↓                       ↓
血清學(xué)試驗  禽眼瞼閉合試驗  小白鼠腹腔注射及中和試驗
    (2)檢驗方法
    ①毒素提取和濃縮。取引起中毒的食品、飼料以及病死動物的胃內(nèi)容物,用生理鹽水做成懸液或取培養(yǎng)液的濾液500ml,可加5%明礬水溶液2.5ml(或l%羥基氯化鋁5m1)。按一個方向輕輕攪拌5min,靜置至結(jié)絮,經(jīng)薄脫脂棉層過濾。用lo一15ml的水洗下結(jié)絮,以1000r/mir離心lmin(或待其自然沉降),棄去上清液收集絮凝物,用pH6.5的o.2%明膠緩沖液溶解絮疑物。若室溫超過25℃,應(yīng)在冰浴中處理標(biāo)本,以免毒素活性降低。
    ②小白鼠腹腔接種法。取15~25g的小白鼠分成3組,每組2~3只。1組:腹腔接種被檢標(biāo)本的稀釋液o.5mi;2組:腹腔接種經(jīng)沸水浴處理10min的被檢標(biāo)本稀釋液o.5ml;3組:腹腔接種被檢標(biāo)本與等量不同稀釋率的抗毒素混合液lml。觀察2~6h,之后早晚2次,共觀察4天。若1組的小鼠出現(xiàn)明顯腹壁震顫、縮陷、“失聲”(用鑷子夾尾巴時不能叫)、隨后呼吸困難、眼球突出、zui后死亡;而2組、3組小鼠仍然健活。這表明被檢標(biāo)本中存在肉毒毒素。
    ③禽眼瞼閉合試驗。在投有小白鼠的情況下,可選用禽類(如雞、鴿子等),做眼瞼注射。接種量可視禽的大小選用,一般注射0.1~0.3ml。具體操作:用藍(lán)芯注射器從禽的內(nèi)眼角向下注射眼險皮下。注射后眼瞼隆起,幾分鐘后接種液被吸收,眼瞼復(fù)原。然后視注入液中的毒素含量多少,導(dǎo)致閉合時間的早晚不同,毒素含量越多閉眼越快。如注入含量為幾個小鼠致死量的毒素,一般可使試驗動物在1-l0h內(nèi)出現(xiàn)閉眼癥狀;如毒素量超過對禽體的致死量,則出現(xiàn)麻痹性癱瘓和呼吸困難等癥狀后經(jīng)幾十分鐘到幾小時死亡;如注射后20rain內(nèi)出現(xiàn)死亡,應(yīng)判斷為注射失敗。
    ④血清學(xué)試驗
    反向間接血凝試驗  用各型抗毒素致敏已固定、鞣化的人紅細(xì)胞。即可用于毒素檢測。本法可將毒素分型,且有較高的特異性和敏感性。
    對流免疫電泳  用pH8,6的巴比妥緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠鋪于7cm×10cm玻璃板上,打出相距6mm的兩列孔。其中一列分別加入被檢樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)毒素稀釋液20,uL;另一列加入抗毒素血清20uL。在60mA、6~8V/cm條件下電泳45-60min,觀察有無沉淀線出現(xiàn)。本法重復(fù)性好,但其敏感性不如反向間接血凝法。
 
    ELISA多用雙抗體夾心法檢測肉毒毒素
    其方法為在聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板上先加抗毒素血清包被過夜,洗滌后,加入待檢標(biāo)本,37℃下孵育90min,再經(jīng)洗滌后加入兔的抗毒素血清,37℃孵育90min,再次洗滌后加入羊抗兔IgG-酶結(jié)合物,37℃孵育90min,洗滌后加入底物溶液,其他操作同ELISA常規(guī)法。
 
    人類肉毒中毒主要有3種類型。a食物性肉毒中毒。主要是由于進(jìn)食了含有肉毒毒素的食品引起的,也是人類肉毒中毒的zui普遍的一種形式。b嬰兒肉毒中毒。由于新生兒正常腸道菌群缺乏,其食人的肉毒梭菌芽孢可以萌發(fā)、繁殖、產(chǎn)生毒素,從而引起嬰兒中毒。c創(chuàng)傷性肉毒中毒,類似于破傷風(fēng),由于傷口處污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、產(chǎn)毒,毒素從傷口進(jìn)入血液循環(huán)而導(dǎo)致,臨床上較少見。
 
    肉毒中毒的實驗室診斷和定型主要是依據(jù)肉毒毒素、病原菌的檢出,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)毒試驗和診斷血清的中和試驗。按GB/T4789.12-2003的方法規(guī)定要求,一個在流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷上已明確的食物中毒,其樣品在實驗室的確診上所需的zui少時間是10天。

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