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利用玻璃微珠裂解酵母細(xì)胞

2012-10-8  閱讀(2269)

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裂解酵母菌的方法是將玻璃微珠和菌細(xì)胞一起渦旋振蕩進(jìn)行機(jī)械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速轉(zhuǎn)動(dòng)撞擊酵母菌從而機(jī)械破碎裂解酵母細(xì)胞。由此可見,這是一種強(qiáng)有力的裂解方法,但在裂解過(guò)程中又傳輸大量的能量,導(dǎo)致樣本的變性。因此,和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究比較,酵母菌的免疫沉淀試驗(yàn)并不是一個(gè)好的方法,特別是研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)時(shí),該方法是不可取的。

 
    1.準(zhǔn)備工作
    由于免疫沉淀有多個(gè)步驟,且包括數(shù)小時(shí)孵育,因此在實(shí)驗(yàn)開始前必須安排好時(shí)間,注意適當(dāng)利用過(guò)夜孵育的間隙。這將有助于決定何時(shí)開始裂解細(xì)胞。同時(shí)應(yīng)注意,
酵母菌免疫沉淀的本底水平非常高,因此推薦進(jìn)行預(yù)處理和使用蛋白酶。
 
    2.所需溶液
    PBS,裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑,置冰上預(yù)冷),玻璃微珠(500umol/L,冷藏)。
 
    3.操作步驟
    (1)4000g離心5min收集酵母菌,去上清液。重懸浮于PBS,離心,棄去PBS。
    (2)將酵母團(tuán)再次懸浮于少量預(yù)冷的裂解液。通常用大約3倍體積的RIPA緩沖液(150mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS和50mmol/L Tris,pH8.0)。同時(shí)應(yīng)加入蛋白酶抑制劑。置冰上。
    (3)玻璃微珠(直徑500~mol/L),用1mol/I鹽酸和裂解緩沖液分別洗滌2次。然后置于少量裂解緩沖液內(nèi),413保存。
    (4)在重懸浮的酵母細(xì)胞內(nèi)加入等體積預(yù)冷的玻璃微珠。
    (5)劇烈渦流振蕩30s,重復(fù)操作直至大部分酵母細(xì)胞裂解。
    (6)將細(xì)胞裂解物連同玻璃微珠以10 000g離心5min。仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管,置冰上。
此時(shí),上清液可以用于下一步預(yù)處理。
 
    4.常見問(wèn)題
    該方法常見問(wèn)題是蛋白質(zhì)抗原的變性。解決方法是用某些能破壞細(xì)胞壁的酶處理酵母菌使其形成原生質(zhì)體,然后再用去污劑將其裂解。這是一個(gè)有效的方法,但酶的價(jià)格昂貴,限制了該方法常規(guī)應(yīng)用于大容量標(biāo)本的制備。然而對(duì)于所研究的關(guān)鍵蛋白的精細(xì)分析,仍不失為一個(gè)有效的方法。

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