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再擴增scFv基因文庫以添加限制性位點進(jìn)行克隆

2013-3-7  閱讀(1857)

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[器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備。除了用Taq聚合酶緩沖液替代Vent聚合酶緩沖液。各自在適宜緩沖液中保存的Tdg聚合酶,均可使用。
● V區(qū)特異性正向 (3’)(JκFORNot和JλFORNot)和反向(5’) (VHBACKSfi PCR引物
● 已組裝的scFv基因文庫
● Wizard PCR純化試劑盒(Promega)

[方法]
1.在0.5ml微量離心管中,配制兩個50/z1PCR反應(yīng)混合液(1個用于VH—VκscFv文庫, 另1個用于Vu—Vλ scFv文庫),其中含有:
● 水,36.5//1
● 10XTag緩沖液,5.0ul
● 20XdNTP, 2.5ul
● 正向引物,2.0ul
● 反向引物,2.0ul
● scFv基因文庫(約long), 1.0ul
2.在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃,5分鐘。如果沒有加熱蓋,則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。
3.加入1.0ul(5單位)TdQDNA聚合酶。
4.以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘的條件共循環(huán)25次,擴增scFv基因。
5.用Wizard PCR純化試劑盒,純化PCR產(chǎn)物。

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