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核酸擴(kuò)增工藝的優(yōu)化和質(zhì)量控制工藝優(yōu)化
　 核酸擴(kuò)增工藝在整個(gè)核酸檢測(cè)試劑中zui重要，其涉及的試劑及原材料多，反應(yīng)參數(shù)設(shè)定復(fù)雜，是整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的核心。具體包括檢測(cè)試劑的配制與反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。其中檢測(cè)試劑主要由以下組分組成：引物、探針、Taq酶、UNG酶等；反應(yīng)參數(shù)包括引物與探針濃度、*Tm值、信號(hào)采集溫度等。以HIV-1熒光定量PCR檢測(cè)試劑為例進(jìn)行說(shuō)明。

工藝優(yōu)化

1．引物探針的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

引物探針的設(shè)計(jì)與質(zhì)量控制見(jiàn)前面*節(jié)，根據(jù)保守的靶序列，按照HIV引物探針設(shè)計(jì)的要求設(shè)計(jì)幾對(duì)引物和探針，從中進(jìn)行優(yōu)化選擇。

將這幾對(duì)引物及探針系統(tǒng)經(jīng)過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，顯示須為HIV-1特異序列。對(duì)HIV全基因組克隆質(zhì)粒系列稀釋物進(jìn)行檢測(cè)，能夠檢測(cè)到10個(gè)分子/PCR反應(yīng)引物探針系統(tǒng)為待選的引物探針系統(tǒng)。將待選的引物探針系統(tǒng)對(duì)臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)具有較好的特異性與敏感性，同時(shí)應(yīng)對(duì)HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)。

2．反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化

將HIV靶序列RT-PCR產(chǎn)物克隆到T載體上，酶切線形化后稀釋成不同濃度的樣本，從引物濃度、熒光探針濃度和PCR循環(huán)參數(shù)幾個(gè)方面進(jìn)行反應(yīng)參數(shù)的選定。

1)反應(yīng)參數(shù)的確定：根據(jù)引物Tm值、產(chǎn)物大小在梯度PCR儀上進(jìn)行不同延伸溫度的測(cè)定，根據(jù)zui適的延伸溫度確定*熒光信號(hào)采集溫度。

2)引物、探針濃度的確定：不同濃度引物、探針組合后對(duì)系列稀釋的病毒RNA檢測(cè)，以確定zui適的引物、探針濃度。

3．防污染的優(yōu)化

擴(kuò)增的產(chǎn)物污染引致的PCR假陽(yáng)性是PCR實(shí)驗(yàn)污染的主要來(lái)源，可用UNG-dUTP系統(tǒng)有效去除，具體過(guò)程為：擴(kuò)增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP)，故產(chǎn)物中含尿嘧啶核苷(du)后續(xù)擴(kuò)增之前，在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG)，在預(yù)變性加熱時(shí)，若體系中存在前一次擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂，不可能作為下一次擴(kuò)增的模板，從而達(dá)到消除污染的目的。