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核酸擴增工藝的優(yōu)化和質量控制工藝優(yōu)化
　 核酸擴增工藝在整個核酸檢測試劑中zui重要，其涉及的試劑及原材料多，反應參數(shù)設定復雜，是整個檢測反應的核心。具體包括檢測試劑的配制與反應參數(shù)的設置。其中檢測試劑主要由以下組分組成：引物、探針、Taq酶、UNG酶等；反應參數(shù)包括引物與探針濃度、*Tm值、信號采集溫度等。以HIV-1熒光定量PCR檢測試劑為例進行說明。

工藝優(yōu)化

1．引物探針的設計與優(yōu)化

引物探針的設計與質量控制見前面*節(jié)，根據(jù)保守的靶序列，按照HIV引物探針設計的要求設計幾對引物和探針，從中進行優(yōu)化選擇。

將這幾對引物及探針系統(tǒng)經(jīng)過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫比對，顯示須為HIV-1特異序列。對HIV全基因組克隆質粒系列稀釋物進行檢測，能夠檢測到10個分子/PCR反應引物探針系統(tǒng)為待選的引物探針系統(tǒng)。將待選的引物探針系統(tǒng)對臨床血清樣本進行檢測，應具有較好的特異性與敏感性，同時應對HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸檢測無交叉反應。

2．反應參數(shù)的優(yōu)化

將HIV靶序列RT-PCR產(chǎn)物克隆到T載體上，酶切線形化后稀釋成不同濃度的樣本，從引物濃度、熒光探針濃度和PCR循環(huán)參數(shù)幾個方面進行反應參數(shù)的選定。

1)反應參數(shù)的確定：根據(jù)引物Tm值、產(chǎn)物大小在梯度PCR儀上進行不同延伸溫度的測定，根據(jù)zui適的延伸溫度確定*熒光信號采集溫度。

2)引物、探針濃度的確定：不同濃度引物、探針組合后對系列稀釋的病毒RNA檢測，以確定zui適的引物、探針濃度。

3．防污染的優(yōu)化

擴增的產(chǎn)物污染引致的PCR假陽性是PCR實驗污染的主要來源，可用UNG-dUTP系統(tǒng)有效去除，具體過程為：擴增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP)，故產(chǎn)物中含尿嘧啶核苷(du)后續(xù)擴增之前，在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG)，在預變性加熱時，若體系中存在前一次擴增產(chǎn)物的污染，污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂，不可能作為下一次擴增的模板，從而達到消除污染的目的。