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技術(shù)文章

撫生試劑-核酸擴(kuò)增工藝的優(yōu)化和質(zhì)量控制工藝優(yōu)化

閱讀:139          發(fā)布時間:2014-4-11

核酸擴(kuò)增工藝的優(yōu)化和質(zhì)量控制工藝優(yōu)化
  核酸擴(kuò)增工藝在整個核酸檢測試劑中zui重要,其涉及的試劑及原材料多,反應(yīng)參數(shù)設(shè)定復(fù)雜,是整個檢測反應(yīng)的核心。具體包括檢測試劑的配制與反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。其中檢測試劑主要由以下組分組成:引物、探針、Taq酶、UNG酶等;反應(yīng)參數(shù)包括引物與探針濃度、*Tm值、信號采集溫度等。以HIV-1熒光定量PCR檢測試劑為例進(jìn)行說明。

工藝優(yōu)化

1.引物探針的設(shè)計與優(yōu)化

引物探針的設(shè)計與質(zhì)量控制見前面*節(jié),根據(jù)保守的靶序列,按照HIV引物探針設(shè)計的要求設(shè)計幾對引物和探針,從中進(jìn)行優(yōu)化選擇。

將這幾對引物及探針系統(tǒng)經(jīng)過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫比對,顯示須為HIV-1特異序列。對HIV全基因組克隆質(zhì)粒系列稀釋物進(jìn)行檢測,能夠檢測到10個分子/PCR反應(yīng)引物探針系統(tǒng)為待選的引物探針系統(tǒng)。將待選的引物探針系統(tǒng)對臨床血清樣本進(jìn)行檢測,應(yīng)具有較好的特異性與敏感性,同時應(yīng)對HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸檢測無交叉反應(yīng)。

2.反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化

將HIV靶序列RT-PCR產(chǎn)物克隆到T載體上,酶切線形化后稀釋成不同濃度的樣本,從引物濃度、熒光探針濃度和PCR循環(huán)參數(shù)幾個方面進(jìn)行反應(yīng)參數(shù)的選定。

1)反應(yīng)參數(shù)的確定:根據(jù)引物Tm值、產(chǎn)物大小在梯度PCR儀上進(jìn)行不同延伸溫度的測定,根據(jù)zui適的延伸溫度確定*熒光信號采集溫度。

2)引物、探針濃度的確定:不同濃度引物、探針組合后對系列稀釋的病毒RNA檢測,以確定zui適的引物、探針濃度。

3.防污染的優(yōu)化

擴(kuò)增的產(chǎn)物污染引致的PCR假陽性是PCR實驗污染的主要來源,可用UNG-dUTP系統(tǒng)有效去除,具體過程為:擴(kuò)增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP),故產(chǎn)物中含尿嘧啶核苷(du)后續(xù)擴(kuò)增之前,在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG),在預(yù)變性加熱時,若體系中存在前一次擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂,不可能作為下一次擴(kuò)增的模板,從而達(dá)到消除污染的目的。

 

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