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如何才能選對你的共聚焦顯微鏡?有什么具體方法?

閱讀:2317        發(fā)布時間:2013-5-6

  共聚焦顯微鏡比寬場顯微鏡具有更多的優(yōu)勢,共聚焦顯微鏡可以對樣品做連續(xù)光學切片并排除非焦平面的信號干擾,為此共聚焦顯微鏡的應用也的確更為普遍。不過市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來越多,要如何進行選擇呢?
  
  共聚焦顯微鏡比寬場顯微鏡具有更多的優(yōu)勢,共聚焦顯微鏡可以對樣品做連續(xù)光學切片并排除非焦平面的信號干擾,為此共聚焦顯微鏡的應用也的確更為普遍。不過市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來越多,要如何進行選擇呢?在選擇共聚焦顯微鏡時,zui基本也zui重要的考慮因素主要有兩點:您想要研究的樣本類型(如:固定的細胞還是活細胞),以及您想要進行的檢測類型(如:靜態(tài)還是動態(tài)細胞過程)。
  
  固定細胞的共聚焦成像
  
  要對固定且染色了的細胞或組織成像,我們一般選擇激光掃描共聚焦(LSCM)。這主要是因為固定的死細胞缺乏活細胞中的快速生物學事件,能更好的受益于LSCM較高的空間分辨率。LSCM成像是通過激光對樣品進行光學層切,掃描速度(取決于掃描陣鏡速度)一般為1fps。曝光時間越長意味著光漂白的風險越大,但對于固定的死細胞,時間并不是很關鍵,我們可以通過拍多張圖片來平均。
  
  活細胞的共聚焦成像
  
  成像活細胞需要額外的保護,以免不友好環(huán)境的干擾。在成像時,我們首先需要考慮的是保持細胞的活性和健康,恒溫加熱元件和灌流系統(tǒng)是*的,尤其對于進行time-lapse(時間序列)的研究來說。控制活細胞生理狀態(tài)的快速生化事件是大多數(shù)人zui想要研究的,但這些事件對于傳統(tǒng)LSCM來說太快了。此外,LSCM的長時間曝光還會引發(fā)毒性光照損傷細胞。因此,對活細胞進行成像會需要特殊的共聚焦顯微鏡。
  
  對活細胞進行共聚焦成像一般有兩個選擇:快速掃描的激光掃描共聚焦和轉盤共聚焦??焖賿呙韫簿劢?strong>顯微鏡用較快的共振掃描陣鏡(resonantscanningmirrors)取代較慢的galvanometersmirrors,能使掃描速度達到30fps;而轉盤共聚焦(SDCMs)的優(yōu)勢在于掃描速度更快(雖然不可避免的要損失空間分辨率),其速度理論上可達到2000fps(實際上往往受到其他因素的限制)。
  
  如果您擔心光漂白或者很弱的熒光信號,那么SDCM可能更加適合。SDCM采用兩個帶有陣列微孔的轉盤轉動來分散激發(fā)光,不同于LSCM對樣品進行點掃描,SDCM一次采集多個點(大約100個像素點),因而速度大大增加,并且SDCM的光漂白及光毒性更小。不過,您也可以采用快速掃描共聚焦來提高掃描速度,配合高靈敏檢測器,降低激發(fā)光能量來減少光毒性,這樣能夠保證傳統(tǒng)共聚焦的豐富功能。
  
  自動化共聚焦成像系統(tǒng)
  
  一些研究者喜歡想方設法對顯微鏡進行改造,以適應自己的個性化需求。而有些研究者則對顯微鏡到底是如何工作的根本不敢興趣。對于后者而言,一臺自動化的共聚焦顯微鏡可能更合他們胃口。舉例來說,OlympusFluoViewFV10i就是這樣一臺全自動桌面型4激光共聚焦顯微鏡,其緊湊的整合結構對安裝空間基本沒有要求。這類儀器非常適合那些需要每天做很多圖像數(shù)據(jù)采集的研究者,當然它們并不能*體現(xiàn)傳統(tǒng)共聚焦的功能及靈活擴展性。此外,NikonA1也是一套全自動共聚焦系統(tǒng)。與大多數(shù)傳統(tǒng)共聚焦掃描顯微鏡一樣,NikonA1采用galvanometer掃描頭,其分辨率比采用混合式掃描頭的A1R高,但速度稍遜(A1R約30fps)。
  
  增加對各種共聚焦顯微鏡類型的了解,可以幫您找到zui適用的儀器。如今,即使不考慮全自動系統(tǒng),不論您選擇什么機型,大多數(shù)系統(tǒng)都內置有豐富的人性化功能,可以使您收益匪淺。
  
  原文提到的掃描速度并沒有標注對應的掃描分辨率,僅供參考,具體數(shù)據(jù)請查閱相應產(chǎn)品資料。
  
  現(xiàn)在,共聚焦顯微鏡正不斷向更快速、更靈敏、更高分辨率及更好的可擴展性發(fā)展,不斷有新技術誕生。速度方面,有共振快速掃描頭及轉盤共聚焦;靈敏度方面有AOBS分光系統(tǒng)及更靈敏的檢測器(HyD,GaAspPMT);分辨率方面有超高分辨率(SIM,STED,PALM,STORM);此外還有多光子、白激光、SMD等技術。我們在選擇共聚焦系統(tǒng)時能多聽聽各廠家的介紹,以便對這些技術有所了解,根據(jù)自己可能進行的研究選擇zui合適的儀器。

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