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定位候選克隆
點擊次數(shù)：1216 發(fā)布時間：2016-9-13
當(dāng)前，人類基因組研究的重心正在由“結(jié)構(gòu)”向“功能”轉(zhuǎn)移，一個以基因組功能研究為主要內(nèi)容的所謂“后基因組時代”(post-genomics)，也即功能基因組(functional genomics)時代，即將到來。如何獲取基因的功能信息，即與人類重大疾病和重要生理功能相關(guān)的基因信息，就擺在了我們面前。定位候選克隆策略(positional candidate cloning)是傳統(tǒng)定位克隆(positional cloning)的改進(jìn)和發(fā)展，并以其在克隆疾病相關(guān)基因中的有效性而日益受到重視。
人類基因組計劃已確定了一系列分布于全基因組24條染色體上的分子標(biāo)記。根據(jù)這些分子標(biāo)記的序列和定位信息，結(jié)合雜交或PCR的方法可以快速檢測染色體上與腫瘤或遺傳性疾病相關(guān)的熱點位置，進(jìn)而從中克隆疾病相關(guān)基因。定位候選克隆克服了經(jīng)典的定位克隆純粹依靠連鎖分析進(jìn)行染色體定位的繁冗而緩慢的弊端，大大加快了克隆工作的進(jìn)程，而且它也不僅僅局限于遺傳病，現(xiàn)在已更多地運用于腫瘤易感基因的克隆工作。1994年上開始構(gòu)建并于1996年公布的基因圖譜是一個以cDNA為基礎(chǔ)的STS(sequence-tagged site)標(biāo)記的物理圖和多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳圖相結(jié)合的圖譜，它一方面使染色體定位更加準(zhǔn)確、可靠、精密，同時為從候選區(qū)域內(nèi)獲得疾病相關(guān)的候選基因提供了極大的便利，使得目的基因的克隆更加簡便而快捷，為這種方法的發(fā)展和應(yīng)用注入了更大的活力，表現(xiàn)為此后相繼克隆出16條新的疾病相關(guān)基因，如從胰腺癌中分離得到的抑癌基因DPC4等。1998年10月GeneBank公布了的“基因圖譜98”，它的信息量更大，且準(zhǔn)確度和度都有大幅度的提高，包含有41 464個STS標(biāo)記，代表了30 181條基因的定位信息，也即完成了人的全部基因組約6萬～7萬條基因中的一半左右的定位工作［2］?？傊?，隨著人類基因組計劃的推進(jìn)，定位候選克隆已成為一種有效的克隆疾病相關(guān)基因的方法。
包括三個基本步驟：基因組定位、候選cDNA的獲得、全長及功能分析。本文即對此策略的發(fā)展和應(yīng)用作一概要介紹。
1.基因組定位
新發(fā)展起來的，尤其在分離腫瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法檢測多樣本的雜合性丟失(LOH)或純合性丟失的高發(fā)頻率區(qū)，從而獲得疾病候選基因定位［3］。體細(xì)胞抑癌基因的失活是導(dǎo)致癌變的一個主要因素，zui常見的表現(xiàn)即雜合性缺失。通常在染色體上雜合性缺失的高發(fā)頻率區(qū)含有一個或多個抑癌基因。利用散布于各條染色體上的分子標(biāo)記(包括STS、微衛(wèi)星標(biāo)記等)，用pcr檢測多個腫瘤樣本的染色體各區(qū)帶的缺失情況，可確定LOH的高發(fā)頻率區(qū)，也即確定了相關(guān)腫瘤生長負(fù)調(diào)控因子的染色體定位，并可到基因組分子標(biāo)記指示的區(qū)域，進(jìn)一步可作基因的克隆工作。利用這一方法已成功地克隆了幾個抑癌基因，如乳腺癌中的BRCA1、BRCA2及胰腺癌中的DPC4基因等。同時，F(xiàn)ISH技術(shù)的不斷發(fā)展及推廣應(yīng)用，染色體顯微切割技術(shù)的成熟，可在顯微鏡下切割特定的染色體區(qū)帶，制備染色體區(qū)帶特異探針，對正常和病變組織作FISH分析，比較確定疾病相關(guān)基因的染色體區(qū)帶定位。近些年來，RH譜(radiation hybrid map)的建立，使染色體精細(xì)定位成為可能。這些方法比原先連鎖分析的檢測速度更快、度更高。例如L-C Tsui用連鎖分析花費了大約10年的時間才把囊性纖維變性基因定位在7號染色體，而現(xiàn)在可能只要一年或更短的時間就可完成這項工作。
2.候選cDNA的篩選
基因組定位提供的信息包含一定的分子標(biāo)記，可用PCR或雜交的方法直接從YAC(yeast artificial chromosome)庫，或從BAC(bacterial artificial chromosome)庫、PAC(P1 artificial chromosome)庫中篩選相對應(yīng)的克隆。YAC庫的嵌合性嚴(yán)重且操作難度較大，已逐步為PAC庫和BAC庫取代。PAC系統(tǒng)是以噬菌體P1為基礎(chǔ)的克隆系統(tǒng)，它可容納70～100kb的插入片段，并可選擇性地區(qū)分重組子和非重組子，且同時有兩套復(fù)制機制。單拷貝復(fù)制子可用于穩(wěn)定克隆增殖，而多拷貝復(fù)制子則可在Lac操縱子的控制下用于DNA的制備［4］。BAC系統(tǒng)是基于大腸桿菌中可大容量容納基因且穩(wěn)定性良好的F因子衍生而來的載體系統(tǒng)，可容納超過100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均長度為120kb，zui大可達(dá)到240kb左右［5］。良好的穩(wěn)定性和操作的簡便性是BAC系統(tǒng)的主要優(yōu)點。由這些克隆入手，采用依賴于適當(dāng)cdna文庫的方法、依賴于特征序列的方法或依賴于表達(dá)性質(zhì)等方法獲得候選cDNA。
(1) 依賴適當(dāng)cDNA文庫的方法有直接篩選法和cDNA選擇法(cDNA selection)。直接篩選法即用基因組DNA直接從cDNA文庫中篩選位于該基因組片段內(nèi)的cDNA，如從覆蓋有候選區(qū)域的YAC［6］、PAC［7］、BAC克隆中分離外源片段作為探針從文庫中篩選候選基因；而cDNA選擇法［8］恰恰與直接篩選法相反，它把基因組DNA固定在膜上，用總cDNA與之雜交，通過PCR從中回收可與基因組片段結(jié)合的cDNA片段。直接篩選法的優(yōu)點在于避免了對候選區(qū)域大片段地亞克隆操作，且在單一的篩選中可以獲得多個轉(zhuǎn)錄子的信息。但缺點是大片段地純化，標(biāo)記較困難，而PAC、BAC克隆片段純化相對方便的優(yōu)點就成為這種方法發(fā)展的趨勢；同時由于探針的復(fù)雜性，使雜交背景加深，假陽性增多，而且容易忽略短的外顯子或低豐度cDNA。cDNA選擇法的zui大*性在于PCR反應(yīng)的介入，大大提高了選擇的靈敏度，可以檢測到一些稀有轉(zhuǎn)錄子。