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細(xì)胞熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1194 發(fā)布時(shí)間：2017-3-8
熒光法較一般光學(xué)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來熒光組織化學(xué)特別是免疫熒光技術(shù)有了很大的發(fā)展。利用熒光技術(shù)可研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的分布與定位，研究細(xì)胞與組織中物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)行病理鑒別以及細(xì)胞免疫等方面的研究。
當(dāng)用一種波長的光(如紫外光)照射某種物質(zhì)時(shí)，這種物質(zhì)會(huì)在極短的時(shí)問內(nèi)發(fā)射出較照射波長為長的光(可見的光)，這種光就稱為熒光。有些生物材料受到紫外線照射后能直接發(fā)出熒光稱自發(fā)熒光(或直接熒光)；有的生物材料受紫外線照射后并不發(fā)光，但當(dāng)它吸收熒光染料后，也同樣產(chǎn)生熒光，稱間接熒光(或次生熒光)。與生物學(xué)有關(guān)的熒光現(xiàn)象有五種：
1、 自發(fā)熒光 如葉綠索、維生素A的紅色熒光、膠原纖維的藍(lán)綠色熒光、脂褐素的藍(lán)色熒光等。
2、 誘發(fā)熒光 通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發(fā)細(xì)胞和組織中生物單胺類(兒茶酚胺、5—羥色胺等)產(chǎn)生熒光。
3、熒光染料染色熒光 即經(jīng)染色后熒光染料與細(xì)胞中某些成分結(jié)合而產(chǎn)生的熒光。
4、酶誘發(fā)熒光 通過細(xì)胞內(nèi)酶的作用，使某些不發(fā)熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)換為發(fā)熒光的產(chǎn)物。如細(xì)胞內(nèi)的脂酶可使不發(fā)熒光的二醋酸熒光素分解為發(fā)熒光的熒光素。
5、免疫熒光 熒光染料和抗體以共價(jià)鍵結(jié)合，這種標(biāo)記的抗體再和相應(yīng)的抗原形成抗原—抗體復(fù)合物，經(jīng)激發(fā)后發(fā)射熒光，用以辨認(rèn)抗原。
細(xì)胞和組織所產(chǎn)生的熒光必須通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察或通過顯微熒光光度計(jì)進(jìn)行定量測定。除少數(shù)生活物質(zhì)含有自發(fā)熒光外，大多數(shù)研究需外加熒光染料，進(jìn)行特異性結(jié)合而得以顯示。.
四．實(shí)驗(yàn)方法
(一)幾種熒光染料對(duì)細(xì)胞染色的觀察
細(xì)胞吖啶橙熒光染色的觀察 ：吖啶橙是zui經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。
1．將生長有培養(yǎng)細(xì)胞的玻片或雞血涂片放入95%乙醇中固定15—30分鐘，干燥；
2．在1%醋酸中酸化30秒；
3．在標(biāo)本片上滴加足量的0．01%吖啶橙磷酸緩沖染液，染色5-10分鐘；
4．用pH4．8磷酸緩沖液洗1分鐘；
5．0.1mol／L氯化鈣分化30秒或幾分鐘；
6．PBS漂洗三次，每次數(shù)秒鐘；
7．在干凈載玻片上滴—滴PBS，將標(biāo)本片有細(xì)胞面向下臨時(shí)封固，或在血涂片上滴加磷酸緩沖液后加蓋玻片臨時(shí)封固；
8．在熒光顯微鏡下觀察，用藍(lán)紫光激發(fā)濾片，可見細(xì)胞核為綠色，細(xì)胞質(zhì)為橙紅色，但常因細(xì)胞質(zhì)的pH值的變化而呈棕色至鮮紅色。
(二)活細(xì)胞雙熒光染色觀察細(xì)胞核和線粒體
一般的生物染料不能穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后改變了細(xì)胞膜的通透性，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但有些活體染料能進(jìn)入活細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，若丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。采用兩種熒光染料的混合染液可對(duì)一個(gè)活細(xì)胞的核和線粒體同時(shí)染色。
1. 用牙簽在自己口腔頰粘膜處刮取上皮細(xì)胞涂于干凈載玻片上；
2.滴一滴雙熒光染液(含0．25ug／mL Ho33342和若丹明123 1ug／mL的PBS液)于細(xì)胞上；
3.加上蓋玻片(注意防止氣泡)，用指甲油把蓋玻片邊緣封好；
4.用落射式熒光顯微經(jīng)觀察。先用高倍鏡觀察細(xì)胞核(采用紫外光激發(fā)濾片／雙色束分離器／內(nèi)裝阻斷濾片的組合插塊置于光路)，可見核發(fā)藍(lán)熒光。再換油鏡觀察線粒體(換用紫光或藍(lán)光的組合插塊)，在細(xì)胞核附近的胞質(zhì)中可見有一些發(fā)綠光的圓形和短稈狀顆粒分布，即為線粒體。
五、熒光組化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題
1．每種熒光染料，均有自己的zui適PH值，此時(shí)熒光zui強(qiáng)。當(dāng)pH改變時(shí)，不僅熒光強(qiáng)度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時(shí)要在一定的PH值的緩沖液中進(jìn)行。
2．一放熒光染色在20。C以下時(shí)熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。
3．在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強(qiáng)而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此用能量小的長波長光進(jìn)行觀察，需照相時(shí)再適當(dāng)增強(qiáng)激發(fā)光。
4．一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標(biāo)本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強(qiáng)度可隨熒光素的濃度增加而增強(qiáng)，但超過限度，熒光強(qiáng)度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。