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上海士鋒生物科技有限公司

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上海士鋒生物Western Blot的原理和所用試劑匯總

點(diǎn)擊次數(shù):682 發(fā)布時(shí)間:2013-8-16

 Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。

原理

SouthernNorthern雜交方法類(lèi)似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),探針是抗體,顯色用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

分類(lèi)

western顯影的方法主要有以下幾種:

1.放射自顯影

2.底物化學(xué)發(fā)光ECL

3.底物熒光ECF

4.底物DAB顯色

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用*種方法,目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行,操作也比較簡(jiǎn)單,原理如下二抗用HRP標(biāo)記:反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發(fā)光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。

主要試劑

1 丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺,應(yīng)以溫?zé)?/span>以利于溶解雙丙稀酰胺的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g,N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,加H2O100ml。儲(chǔ)于棕色瓶,4避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0,因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月,隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀,可以過(guò)濾。

2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去離子水配制,室溫保存。

3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris48ml1mol/LHCL混合,加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。

4 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中,用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備,再用HCL調(diào)節(jié)PH值,而不用Tris.CL。

5 TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí),聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過(guò)硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml,臨用前配制.

6、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巰基乙醇3.2ml,0.05%溴酚藍(lán)1.6ml,H2O 32ml混勻備用。按1:11:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合,在沸水終煮3min混勻后再上樣,一般為20-25ul,總蛋白量100μg

7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸餾水溶解至1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。

8、 轉(zhuǎn)移緩沖液:配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液,需稱(chēng)取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至總量1L。

9 麗春紅染液儲(chǔ)存液:麗春紅S 2g 30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。

10、 脫脂奶粉5%(w/v)

11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉有毒,戴手套操作,溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)

12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)500mmol/LnaCl。

13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。

16 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)

17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

18 100mmol/L NaCl。

19 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA

 

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