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【感受態(tài)細(xì)胞的制備】用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

2013-5-15　　閱讀(2651)

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1. 從37℃培養(yǎng)16~20 h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 ml 新鮮的16~20 h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100ml LB培養(yǎng)基的1 L 或500 ml 培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3 h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測量OD₆₀₀值≈0.4。

2. 在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的50 ml 聚丙烯離心管中，冰上放置10~20 min。

3. 于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細(xì)菌細(xì)胞。

4. 將管倒置1 min，以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

5. 以10 ml 用冰預(yù)冷的0.1 mM CaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細(xì)菌細(xì)胞。

6. 每50 ml 初始培養(yǎng)物用2 ml 冰預(yù)冷的0.1 M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/a>

7. 用無菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200 μl 轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min。

8. 將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中，90 s。

9. 將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因。

10. 將適當(dāng)體積（每個90 mm平板可達(dá)200 μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。

11. 將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12~16 h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。

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