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1. 挑取適當(dāng)菌株的 E.coli 單菌落接種于 2mlSOB 培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。
2. 取 0.5-1ml 過夜培養(yǎng)的菌液 轉(zhuǎn)種到 50ml SOB 中，18℃劇烈震蕩，直到 A600達(dá)到 0.6。
3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心 10min。同時在冰浴 上配置 TB 溶液。
4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。
5. 取 1ml 剛配的 TB 溶液打散菌體沉淀，再加入 15mlTB（1/3 體積的起始培養(yǎng) 液） ，冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心 10min。
6. 棄上清，沉淀重懸于 4mlTB（1/12.5 體積的起始培養(yǎng)液） ，冰浴10min。
7. 加入 280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴 10min。
| 蛋白胨 | 20g |
| 酵母提取物 | 5g |
| NaCl | 0.58g |
| KCl | 0.186g |
| 100×Mg++溶液 | 10ml |
| 溶解并加水定容至 1L，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌 | |
| MgCl2﹒6H2O |
| MgSO4﹒7H2O |
| 溶解并加水定容至 100ml，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌 |
| 1M KCl | 5ml |
| 0.55MMnCl2 | 2ml |
| 0.5M CaCl2 | 0.6ml |
| 0.1MK-Pipes（pH 6.7） | 2ml |
| ddH2O | 10.4ml |
| Total | 20ml |
| 注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理 | |
