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專題:脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法

2013-7-8  閱讀(1565)

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脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時,首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做:*,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間,DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始,按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者*的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時間(2~24小時)。因LR對細(xì)胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。

細(xì)胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

一、操作步驟[方法一]:

1. 取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿),向每孔中加入2mL含1~2×105 個液,37℃CO 培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分,轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

2. 轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應(yīng)酌情減量)。

3. 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

4. 轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

二、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]:

1. 以5×105 細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時,使其達(dá)到50~60%板底面積。

2. 在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下:

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

3. 棄去細(xì)胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物,37℃培養(yǎng)3~5小時。

4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時,

5. 吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養(yǎng)24~48小時。

6. 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,以備分析鑒定。

四、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下:

1. 接種細(xì)胞同前,細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

2. DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前2、3步驟。

3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養(yǎng)48小時。

4. 吸出DMEM,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,使細(xì)胞生長一

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