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專題：轉(zhuǎn)染（transfection）--轉(zhuǎn)染試劑的選擇

2013-7-8　　閱讀(2113)

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下面我們?yōu)榇蠹姨峁┮恍┏Ｓ弥|(zhì)體試劑的適用細胞系信息以及轉(zhuǎn)染FAQs：

1. promega公司

Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。詳情請參閱http：//www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm

2. Invitrogen公司

根據(jù)經(jīng)驗，我公司推薦您使用Invitrogen公司生產(chǎn)的lipofetamine2000試劑盒。適合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各種常用細胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。詳情請參閱http：//invitrogen.com/content.cfm?pageid=4547%20

3. 轉(zhuǎn)染FAQs：

針對同種陽離子脂質(zhì)體的疑難解答

Q1：轉(zhuǎn)染效率低

（1）沒有使用優(yōu)化的陽離子脂質(zhì)體試劑。解決建議：選擇針對您的細胞類型轉(zhuǎn)染效率可能zui高的陽離子脂質(zhì)體試劑。參見附錄A或（www.invitrogen.com）上“Transfection Collection”中的參考文獻列表。

（2）沒有使用優(yōu)化條件。解決建議：優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。參見第7章優(yōu)化步驟。參見（www.invitrogen.com在Tech-online分子生物學(xué)部分）上的細胞特異性的轉(zhuǎn)染步驟。

（3）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。解決建議：在復(fù)合體形成時不要使用血清。OPTI-MEM I培養(yǎng)基和DMEM是用于復(fù)合體形成的較好的培養(yǎng)基。如果使用含有血清的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染，保證在無血清條件形成復(fù)合物。注意：不要將OPTI-MEM I培養(yǎng)基用于LIPOFECTAMINE PLUS試劑或昆蟲細胞。對于Sf9和Sf21細胞，Sf-900Ⅱ SFM會得到*結(jié)果。

（4）存在抑制劑。解決建議：不要在用于制備DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

（5）不恰當(dāng)?shù)募毎芏取＝鉀Q建議：細胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時融合度為70%~90%。

（6）轉(zhuǎn)染DNA的啟動子-增強子沒有被宿主細胞識別。解決建議：確保轉(zhuǎn)染DNA的啟動子-增強子同目的細胞類型兼容。

（7）陽離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。解決建議：不要使用凍結(jié)的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質(zhì)體試劑。

（8）轉(zhuǎn)染分析的問題。解決建議：轉(zhuǎn)染分析中加入陽性對照。

（9）質(zhì)粒純化的問題。解決建議：請核對是否使用轉(zhuǎn)染級的質(zhì)粒純化試劑盒。通常轉(zhuǎn)染級的質(zhì)粒純化試劑盒使用DEAE樹脂而非硅樹脂，并且是用重力流動（過濾）的方法而不是離心技術(shù)，因為樹脂帶來的污染會導(dǎo)致較高的內(nèi)毒素。另一種方法（可用于任何級別的純化試劑盒），是在zui后一步從樹脂柱上洗脫質(zhì)粒后，將溶液置于55℃的水浴上保溫5分鐘。zui后小心地從上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。這是減少樹脂的交叉污染的方法。

Q2：細胞死亡率高。

（1）DNA量太高。解決建議：作一個劑量-反應(yīng)曲線以確定*的DNA量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入陽離子脂質(zhì)體試劑，因為單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎(chǔ)的影響。參見第7章微調(diào)/優(yōu)化方法。

（2）陽離子脂質(zhì)體試劑量太高。解決建議：作一個劑量-反應(yīng)曲線以確定*的陽離子脂質(zhì)體試劑的量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入DNA，因為單獨陽離子脂質(zhì)體試劑也只對細胞生長有一個基礎(chǔ)的影響。參見第7章微調(diào)/優(yōu)化方法。

（3）在轉(zhuǎn)染過程中使用抗菌素。解決建議：在轉(zhuǎn)染過程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因為陽離子脂質(zhì)體試劑使細胞更敏感。

（4）細胞太少。解決建議：作一個劑量-反應(yīng)曲線以確定每個轉(zhuǎn)染過程中*的細胞數(shù)量。根據(jù)您的應(yīng)用所要求的效率調(diào)整細胞數(shù)量。

（5）在無血清條件下細胞活性降低。解決建議：使用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基。降低或省去在無血清培養(yǎng)基中清洗的次數(shù)。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用5%到10%的血清。確保在不存在血清的條件下形成復(fù)合物。

（6）陽離子脂質(zhì)體試劑氧化了。解決建議：不要過分攪動或振蕩陽離子脂質(zhì)體試劑；這可能會形成陽離子脂質(zhì)體試劑的過氧化物。

（7）對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快。解決建議：在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留48小時使細胞表達抗性基因。

Q3：陽離子脂質(zhì)體試劑-DNA復(fù)合物沉淀。注意：在顯微靜下可以在細胞上觀察到小的顆粒狀顆粒沉淀。這是正常的。此沉淀是否存在并不表明轉(zhuǎn)染效率的高低。

A3：
（1）存在過剩的EDTA。解決建議：使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用濃度<0.3mM的EDTA溶液稀釋DNA。
（2）DNA或陽離子脂質(zhì)體試劑濃度過高。解決建議：確保陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA的濃度不要超過復(fù)合物形成的建議量（參見表5）。

Q4：轉(zhuǎn)染重復(fù)性不好。

A4：
（1）轉(zhuǎn)染時的融合度波動。解決建議：在不同的轉(zhuǎn)染時報持所有的轉(zhuǎn)染參數(shù)恒定，如融合度，傳代次數(shù)和生長時相等。

（2）在培養(yǎng)中細胞發(fā)生變化。解決建議：如果可能，使用來源于經(jīng)選擇轉(zhuǎn)染效率較高亞系的細胞。如果可能，融化新鮮細胞。

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