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DNA專題:大腸桿菌 細(xì)菌轉(zhuǎn)化

2013-7-22  閱讀(1638)

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一、原理

質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面,經(jīng)過42°C短時(shí)間的熱擊處理,促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá),就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。

二、器材

旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋),制冰機(jī),恒溫?fù)u床,培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺(tái),酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養(yǎng)箱。

三、試劑

培養(yǎng)基(不加抗菌素),LB培養(yǎng)基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal.

四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。

五、操作步驟

(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。

(3) 加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。

(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。

(5) 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.

(6) 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂)。

(7) 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱

(9) 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

(10)觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑

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