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DNA實驗技術:DNA的酶切實驗

2013-7-27  閱讀(3375)

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采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同(主要是鹽離子濃度不同)或反應溫度不同,這時可以采用如下措施解決:1)先用一種酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切;2)先進行低鹽要求的酶酶切,然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求,加入第二種酶進行酶切;3)使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應要求進行,盡量避免星號活力。

一 材料、試劑和儀器:

1 材料:質(zhì)粒DNA

2 試劑:限制性內(nèi)切酶、ddH2O

3 儀器:微量移液槍,離心機,水浴鍋, 電泳儀,紫外透射觀測儀

實驗程序:

I. .單酶切:

II. 雙酶切:

注:酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系,這樣抑制因素得以稀釋;基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大,一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10,否則濃度會超過5%,會產(chǎn)生星號活力;對難切的質(zhì)?;蚧蚪MDNA應延長反應時間4―5hr, 甚至。滅火限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具體每一種酶可能有些方法不能*滅活,這一點需要注意。

二. 結果與分析:

圖1 重組質(zhì)粒HindIII XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析

假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切*,紫外燈下檢測電泳結果, 則單酶切應為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣(超螺旋、線性和開環(huán)三條帶),則說明質(zhì)粒*沒有被切開。

M1 : λ DNA/ HindIII M2:DL2000 1 - 6: 重組質(zhì)粒HindIII XbaI

重組質(zhì)粒用HindIII XbaI雙酶切后釋放出插入片斷,因此空載體處于同一水平位置,而插入片斷長度分別為0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。

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