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DNA實驗技術(shù):限制性內(nèi)切酶消化DNA實驗

2013-7-27  閱讀(2284)

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標(biāo)簽: 限制性內(nèi)切酶 消化 DNA

影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應(yīng)體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應(yīng)時間來加以克服。

實驗方法

  • 單酶單DNA樣品消化
  • 消化多個DNA
  • 部分消化

實驗方法原理

進(jìn)行限制酶切割反應(yīng)只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液溫育,其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強(qiáng)度、溫育溫度和時間都依具體的反應(yīng)而改變。

實驗材料

DNA

試劑、試劑盒

TE 酶切緩沖液 EDTA

儀器、耗材

電泳儀

實驗步驟

1.  混合下列溶液于一個無菌的微量離心管中


(1)x μl  DNA

(2)2 μl  10×酶切緩沖液

(3)18-x μl  H2O


(4)20 μl 的反應(yīng)體積可以方便地用于聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析。

(5)只要反應(yīng)混合物中其他成分的比例保持一定,可增減待切割DNA的量和反應(yīng)條件。

 

2.  加入限制性內(nèi)切酶(1~5 U/μg DNA)在推薦的溫度溫育1 h (—般是37℃)。

3.  理論上,1 U 限制性內(nèi)切酶在推薦的反應(yīng)條件下,60 min 內(nèi)可*消化1 μg 純化的樣品。

4.  酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的1/10,因為酶液中的可以干擾反應(yīng)。

 

5.  加入5 μl 電泳加樣緩沖液終止反應(yīng),進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳。


6.  反應(yīng)也可通過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA(終濃度為12. 5 mol/l) 以螯合鎂離于而終止。

7.  很多酶再65℃溫育10 min 可被不可逆滅活,有些不能在65℃熱失活的酶在75℃溫育15 min 也能失活。

8.  如果酶對熱具*抗性,可遍過酚抽提和乙醇沉淀或通過硅基質(zhì)懸浮法來純化DNA。

 

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