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RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù):RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和步驟

2013-10-12  閱讀(2117)

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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

掌握植物總RNA非變性膠電泳的原理和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠,不同的RNA條帶也能分開,但無法判斷其分子量。只有在*變性的條件下,RNA的泳動(dòng)率才與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子量時(shí),一定要用變性凝膠。在需快速檢測(cè)所提總RNA樣品完整性時(shí),配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。
 

三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品

蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀,電泳槽,電子天平,移液器,槍頭,微波爐,紫外透射檢測(cè)儀等。 瓊脂糖,1XTAE電泳緩沖液,0.5μg/ml溴化乙錠(EB)10X載樣緩沖液。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠,加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。

(2)在超凈工作臺(tái)上,用移液器吸取總RNA樣品4μl于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上再加入5μl 1×TAE電泳緩沖液及1μl 的10X載樣緩沖液,混勻后,小心加入點(diǎn)樣孔。

(3)打開電源開關(guān),調(diào)節(jié)電壓至100V,使RNA由負(fù)極向正極電泳,約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測(cè)儀上觀察RNA電泳結(jié)果。
 

       

                   

RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測(cè)

試劑:

(1)MOPS緩沖液(10*):0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0),0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

(2)上樣染料:50%甘油,1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍(lán),0.4%二甲苯藍(lán)。

(3)甲醛。

(4)去離子甲酰胺。v電泳槽清洗:去污劑洗干凈(一般浸泡)——水沖洗——乙醇干燥——3%H2O2灌滿——室溫放置10分鐘——0.1%DEPC水沖洗。

操作:

(1) 將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍,晾干備用。

(2) 配制瓊脂糖凝膠。

①稱取0.5g瓊脂糖,置干凈的100ml 錐形瓶中,加入40ml蒸餾水,微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖*溶化均勻。

②待膠涼至60--70 ℃,依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩沖液和0.5ul 溴化乙錠,混合均勻。

③灌制瓊脂糖凝膠。

(3) 樣品準(zhǔn)備:

①  取 DEPC處理過的500ul小離心管,依次加入如下試劑: 10x MOPS緩沖液2ul,甲醛3.5ul,甲酰胺(去離子)10ul,RNA 樣品 4.5ul,混勻。

②  將離心管置于60℃水浴中保10分鐘,再置冰上2分鐘。

③   向管中加入3ul 上樣染料,混勻。

(4)上樣。

(5)電泳:電泳槽內(nèi)加入1XMOPS緩沖液,于7.5V/ml 的電壓下電泳。

(6)電泳結(jié)束后,在紫外燈下檢查結(jié)果。

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