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感受態(tài)制備:農桿菌感受態(tài)的制備和轉化

2013-10-30  閱讀(1323)

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雙元載體的農桿菌轉化

1.1農桿菌感受態(tài)細胞的制備

1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線,28℃培養(yǎng)。

1.1.2. 挑取單菌落接種于5ml YM液體培養(yǎng)基中,220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液轉接于100ml YM液體培養(yǎng)基中,28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5。

1.1.4. 轉入無菌離心管,5000rpm離心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml預冷的0.1M的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置20min。4℃5000rpm離心5min,去上清。

1.1.6. 加入4ml預冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,輕輕懸浮。

1.1.7. 農桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中,每管200μl凍存于-70℃。

1.2. 雙元載體轉化農桿菌EHA105

取1μg左右的質粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細胞中,混勻后,冰浴30min,-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min,接著冰浴2min,加入800mlYM液體培養(yǎng)基28℃,175rpm搖培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培養(yǎng)到形成單菌落。

其中 YM 可以用LB 代替 ,*次的 CaCl2 溶液可用溶液(0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl(7.0) 0.01 DTT)替代。

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