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一、概述

鱟試驗(yàn)是一種zui靈敏和專一的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，通常稱為細(xì)菌內(nèi)毒素(熱原)，與TAL反應(yīng)可形成易于分辨的凝膠。簡單、經(jīng)濟(jì)的鱟試驗(yàn)使得它已廣泛應(yīng)用于注射藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械和環(huán)境中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL反應(yīng)混合物逐漸變渾濁，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合二階反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。借助儀器（注：如我國天津大學(xué)無線電廠BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀。）進(jìn)行動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)，可地檢測出已設(shè)定的濁度。細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用zui小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：

lgT=a+blgC

我們把這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知檢品中的內(nèi)毒素水平是通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來確定的。

二、鱟試劑

定量法鱟試劑*不同于凝膠法鱟試劑，它對鱟血細(xì)胞提取物的純度、溶解度、溶解后的澄明度以及在空氣中其本身色澤穩(wěn)定性都有較高要求。定量法鱟試劑的標(biāo)識值λ表示定量鱟試劑的zui低檢測限，而不是靈敏度，是參考美國標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5標(biāo)定的，用EU/ml標(biāo)示（如：湛江海洋生物制品廠生產(chǎn)的海浪牌定量法鱟試劑。）。

三、復(fù)溶

復(fù)溶前輕彈試劑瓶使瓶中的鱟試劑粉末落到瓶底，小心地打開試劑瓶蓋，避免接觸污染，殘留在試劑瓶蓋上的少量試劑無關(guān)緊要。在使用前按標(biāo)識量復(fù)溶試劑，不立即使用時(shí)用無熱原封口膜封住瓶口，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試劑瓶直到鱟試劑*溶解。如果封口破損或溶解時(shí)出現(xiàn)顏色或混濁則將其丟棄。

四、貯存

凍干的定量法鱟試劑在常溫條件下還是相對穩(wěn)定的，但還是應(yīng)存放在20℃下；避免長時(shí)間放置在高于25℃的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中將其存放在-20℃以下凍結(jié)，僅可能在7天內(nèi)使用，鱟試劑只能凍融一次。

五、警告

正確應(yīng)用該檢測方法要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程中的所有項(xiàng)目，樣品定量試驗(yàn)必須包括回收試驗(yàn)以驗(yàn)證回收率的合格條件。所有與樣品接觸的試驗(yàn)材料必須無內(nèi)毒素，玻璃器皿必須經(jīng)有效除內(nèi)毒素。

六、產(chǎn)品干擾

每一樣品的檢測方法必須經(jīng)過驗(yàn)證證明無明顯的干擾，干擾通常與濃度有關(guān)，可用LAL檢查用水稀釋來克服干擾。

七、zui大有效稀釋

中國藥典2000年版規(guī)定經(jīng)靜脈給藥的藥品的內(nèi)毒素閾值為5EU/kg.hr，鞘內(nèi)藥品為0.2EU/kg.hr。對于一些簡單的藥品也采用特殊限值，這些限值可以用來確定稀釋的范圍以克服干擾問題而不會超過限定的內(nèi)毒素濃度，zui大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是按照文件和藥典中提供的公式來計(jì)算的：

MVD＝內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價(jià)/zui低檢測限

例如，頭孢曲松鈉（2.0mg/支）的內(nèi)毒素限值是0.20EU/mg，如湛江海洋生物制品廠定量法鱟試劑030329zui低檢測限為0.005EU/ml。首先用5ml檢查用水溶解頭孢曲松鈉，產(chǎn)品效價(jià)＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml。

MVD＝內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價(jià)/zui低檢測限

   ＝0.20EU/mg×0.4mg/ml/0.005EU/ml

   ＝16倍

八、日常檢查

標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包括至少三個(gè)內(nèi)毒素濃度，重復(fù)兩管檢測，例如10，1.0和0.1EU/ml。對于半成品或原材料的檢測，從10至0.01EU/ml的四個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能更合適。使用三次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時(shí)，可儲存標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用儲存標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對照誤差必須在±10%以內(nèi)。做回收率試驗(yàn)時(shí)，樣品陽性對照管應(yīng)含有等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度，例如上面介紹的1.0EU/ml。

九、結(jié)果

在整個(gè)檢測過程中，細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀每隔10秒自動(dòng)監(jiān)測吸光度的增加，儀器詳細(xì)記錄每一時(shí)間對應(yīng)的濁度值，濁度0.02值對應(yīng)的這一時(shí)間稱為臨界時(shí)間。細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀軟件自動(dòng)將每一標(biāo)準(zhǔn)品的臨界時(shí)間與它相應(yīng)的內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值進(jìn)行回歸計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的特征并評估確定該標(biāo)準(zhǔn)曲線是否有效。

BET-32 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

鱟試劑：030329                生產(chǎn)：湛江海洋生物制品廠               內(nèi)毒素：2002-12

回歸等式：LogT=2.8849-0.2176LogC

相關(guān)系數(shù)：g=-0.9997

在這個(gè)例子中，注射用棓丙酯的內(nèi)毒素回收率116%，表明注射用棓丙酯在0.5mg/ml這個(gè)濃度時(shí)無干擾，陰性對照在規(guī)定時(shí)間內(nèi)檢測不出內(nèi)毒素值。