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一、概述

鱟試驗(yàn)是一種zui靈敏和專一的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，通常稱為細(xì)菌內(nèi)毒素(熱原)，與TAL反應(yīng)可形成易于分辨的凝膠。簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的鱟試驗(yàn)使得它已廣泛應(yīng)用于注射藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械和環(huán)境中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。

細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL反應(yīng)混合物逐漸變渾濁，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合二階反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。借助儀器（注：如我國(guó)天津大學(xué)無線電廠BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀。）進(jìn)行動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)，可地檢測(cè)出已設(shè)定的濁度。細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對(duì)數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用zui小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：

lgT=a+blgC

我們把這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知檢品中的內(nèi)毒素水平是通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來確定的。

二、鱟試劑

定量法鱟試劑*不同于凝膠法鱟試劑，它對(duì)鱟血細(xì)胞提取物的純度、溶解度、溶解后的澄明度以及在空氣中其本身色澤穩(wěn)定性都有較高要求。定量法鱟試劑的標(biāo)識(shí)值λ表示定量鱟試劑的zui低檢測(cè)限，而不是靈敏度，是參考美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5標(biāo)定的，用EU/ml標(biāo)示（如：湛江海洋生物制品廠生產(chǎn)的海浪牌定量法鱟試劑。）。

三、復(fù)溶

復(fù)溶前輕彈試劑瓶使瓶中的鱟試劑粉末落到瓶底，小心地打開試劑瓶蓋，避免接觸污染，殘留在試劑瓶蓋上的少量試劑無關(guān)緊要。在使用前按標(biāo)識(shí)量復(fù)溶試劑，不立即使用時(shí)用無熱原封口膜封住瓶口，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試劑瓶直到鱟試劑*溶解。如果封口破損或溶解時(shí)出現(xiàn)顏色或混濁則將其丟棄。

四、貯存

凍干的定量法鱟試劑在常溫條件下還是相對(duì)穩(wěn)定的，但還是應(yīng)存放在20℃下；避免長(zhǎng)時(shí)間放置在高于25℃的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中將其存放在-20℃以下凍結(jié)，僅可能在7天內(nèi)使用，鱟試劑只能凍融一次。

五、警告

正確應(yīng)用該檢測(cè)方法要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程中的所有項(xiàng)目，樣品定量試驗(yàn)必須包括回收試驗(yàn)以驗(yàn)證回收率的合格條件。所有與樣品接觸的試驗(yàn)材料必須無內(nèi)毒素，玻璃器皿必須經(jīng)有效除內(nèi)毒素。

六、產(chǎn)品干擾

每一樣品的檢測(cè)方法必須經(jīng)過驗(yàn)證證明無明顯的干擾，干擾通常與濃度有關(guān)，可用LAL檢查用水稀釋來克服干擾。

七、zui大有效稀釋

中國(guó)藥典2000年版規(guī)定經(jīng)靜脈給藥的藥品的內(nèi)毒素閾值為5EU/kg.hr，鞘內(nèi)藥品為0.2EU/kg.hr。對(duì)于一些簡(jiǎn)單的藥品也采用特殊限值，這些限值可以用來確定稀釋的范圍以克服干擾問題而不會(huì)超過限定的內(nèi)毒素濃度，zui大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是按照文件和藥典中提供的公式來計(jì)算的：

MVD＝內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價(jià)/zui低檢測(cè)限

例如，頭孢曲松鈉（2.0mg/支）的內(nèi)毒素限值是0.20EU/mg，如湛江海洋生物制品廠定量法鱟試劑030329zui低檢測(cè)限為0.005EU/ml。首先用5ml檢查用水溶解頭孢曲松鈉，產(chǎn)品效價(jià)＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml。

MVD＝內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價(jià)/zui低檢測(cè)限

   ＝0.20EU/mg×0.4mg/ml/0.005EU/ml

   ＝16倍

八、日常檢查

標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包括至少三個(gè)內(nèi)毒素濃度，重復(fù)兩管檢測(cè)，例如10，1.0和0.1EU/ml。對(duì)于半成品或原材料的檢測(cè)，從10至0.01EU/ml的四個(gè)數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能更合適。使用三次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時(shí)，可儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對(duì)照誤差必須在±10%以內(nèi)。做回收率試驗(yàn)時(shí)，樣品陽性對(duì)照管應(yīng)含有等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度，例如上面介紹的1.0EU/ml。

九、結(jié)果

在整個(gè)檢測(cè)過程中，細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀每隔10秒自動(dòng)監(jiān)測(cè)吸光度的增加，儀器詳細(xì)記錄每一時(shí)間對(duì)應(yīng)的濁度值，濁度0.02值對(duì)應(yīng)的這一時(shí)間稱為臨界時(shí)間。細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀軟件自動(dòng)將每一標(biāo)準(zhǔn)品的臨界時(shí)間與它相應(yīng)的內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的特征并評(píng)估確定該標(biāo)準(zhǔn)曲線是否有效。

BET-32 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

鱟試劑：030329                生產(chǎn)：湛江海洋生物制品廠               內(nèi)毒素：2002-12

回歸等式：LogT=2.8849-0.2176LogC

相關(guān)系數(shù)：g=-0.9997

在這個(gè)例子中，注射用棓丙酯的內(nèi)毒素回收率116%，表明注射用棓丙酯在0.5mg/ml這個(gè)濃度時(shí)無干擾，陰性對(duì)照在規(guī)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)不出內(nèi)毒素值。