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淋巴細胞的分離和激化實驗

2015-5-20  閱讀(1382)

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實驗試劑


1. PBS(Dulbecco):
   0.10g/L 無水CaCl2
   0.20g/L KCl
   0.20g/L KHPO4
   0.10g/L MgCl2.6H2O
   8.00g/L NaCl
   2.16g/L NaH2PO4.7H2O
   調(diào)pH至7.4

2. 生長培養(yǎng)基:
   不含谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基
   10% FBS
   慶大霉素(可不用)(10μg/ml)
   2mmol/L L-谷氨酰胺
   1mmol/L 丙酮酸鈉

3. 促細胞分裂劑(終濃度)
   5μg/ml PHA:1mg/ml母液-20℃分裝凍存
   25μg/ml 刀豆凝集素A(conA):0.4mg/ml母液-20℃分裝凍存
   商陸促分裂原:再水華母液-20℃分裝凍存


錨點

實驗步驟


1. 收集10ml全血,加入不含防腐劑的肝素(0.2ml肝素/10ml全血)。實驗全過程保持無菌操作。
2. 在15ml離心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖,室溫放置20~30min,沉降紅細胞。沉降時間不宜過長,否則單核細胞將不再保留在富含白細胞的血漿。
3. 從葡聚糖處理的血中小心收集紅細胞上層的富含白細胞的血漿。
4. 富含白細胞的血漿室溫300g離心8min,沉淀細胞。
5. 棄上清,細胞輕懸于1ml PBS中。
6. 于室溫下,用無菌巴斯德吸管小心將細胞懸液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技術(shù)熟練,才能保持血漿曾在Ficoll-Hypaque層之間界面清晰。
7. 400g低溫(4℃)離心30min,沉淀細胞。離心后切記不要破壞管中的分層。
8. 淋巴細胞在血漿和Ficoll-Hypaque層之間的白色渾濁條帶中,小心取出貯存,棄紅細胞沉淀。
9. 5ml PBS洗一次細胞,室溫250g離心5min,沉淀細胞懸于3~5ml生長培養(yǎng)基中。
10. 全部細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25組織培養(yǎng)瓶,加促細胞分裂劑。

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