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生物素酰化探針的檢測實驗
與放射性標記探針的比活不同，生物素標記探針的可檢出性在于每千堿基對中摻入的生物素分子的數(shù)量，它可用比色法檢測。
實驗方法
- 比色法
- 化學發(fā)光法
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 磷酸酶緩沖液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT |
| 儀器、耗材 | 離心機 分光光度計 搖床 |
| 實驗步驟 | 1. 用DNA稀釋緩沖液，稀釋生物素?；瘶藴蔇NA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測DNA。 2. 對干硝酸纖維素濾膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，在80℃供干約1 h接步驟4。 3. 對于足龍膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，晾干后用紫外照射法將DNA交聯(lián)至膜上。接步驟4或化學發(fā)光檢測。 4. 用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大?。?，用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。 5. 稀釋10 μl 親和素-AP交聯(lián)物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯(lián)物代替，重新封口，在旋轉(zhuǎn)平臺室溫揺蕩10 min。 6. 從袋中取出濾膜移到一個淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖蕩。 7. 加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混勻。 8. 在淺盤中避光溫育溶液，不時觀察直至發(fā)色達到滿意程度為止。 9. 加TE pH8.0以終止反應，比較測定DNA樣品和標準DNA的顏色強度以確定生物素?；痙NTP的摻入效率。如果該探計至少有一半標準品的強度，它可作為探針用于原位雜交。 |
