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用于豬瘟病毒診斷的高敏配對(duì)單抗上市

• 研究背景

豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對(duì)稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制,不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關(guān)抗原。該病毒對(duì)**敏感，對(duì)溫度、紫外線、化學(xué)消毒劑等抵抗力較強(qiáng)。

豬瘟病毒能在豬胚或乳豬脾、腎、骨髓、淋巴結(jié)、白血球、結(jié)締組織或者肺組織的細(xì)胞中培養(yǎng)，但在這些細(xì)胞上不產(chǎn)生明顯病變。可利用雞新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)（END試驗(yàn))測(cè)定豬瘟病毒，作為診斷豬瘟的一種方法。

臨床診斷方法有：1.動(dòng)物接種試驗(yàn)易感豬接種是檢測(cè)豬瘟病毒的敏感方法。采取發(fā)病豬的血液或病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體等組織制成乳劑，無菌處理后接種易感豬（10-20Kg），觀察發(fā)病情況，然后再分離病毒。通常采用兔體交叉免疫試驗(yàn)。2、檢測(cè)血清抗體檢測(cè)血清抗體可為豬瘟免疫提供依據(jù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)非典型豬瘟和溫和性豬瘟有重要作用。3、檢測(cè)豬瘟病毒直接免疫熒光抗體技術(shù)是檢測(cè)豬瘟病毒的一種快速診斷方法，該方法是采取豬的扁桃體或者豬腎、脾等組織做冰凍切片或觸片，經(jīng)丙酮固定，熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，如果這些組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有亮綠色熒光，說明細(xì)胞內(nèi)存在豬瘟病毒，即可診為豬瘟。

   應(yīng)市場(chǎng)需要，我們山東綠都生物食品安全檢測(cè)事業(yè)部歷時(shí)2年時(shí)間，開發(fā)了38株抗豬瘟鼠單抗，經(jīng)過配對(duì)測(cè)試，找出1組可以配對(duì)成功，并投入了市場(chǎng)進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

二，目的意義

1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測(cè)各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，指導(dǎo)客戶與有關(guān)監(jiān)督部門考核產(chǎn)品。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測(cè)豬瘟病毒。

• 鼠單抗質(zhì)量鑒定

①免疫熒光鑒定

1.ST細(xì)胞鋪96孔板一個(gè)，同時(shí)接毒，按照5%接毒，每孔接50ul。

2.48-120小時(shí)測(cè)定熒光。用0.01Mpbs洗三次后棄掉pbs，拍干。 3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分鐘，放入-20℃后棄掉上清，不拍板。

4.pbs洗三次，棄上清，不用拍板，吸干水分。

5.加入一抗，按照0.1 mg/ml加入。37℃防置40分鐘，pbs洗三次，吸干水分。

6.加入二抗（按1:40加入，pbs稀釋）37 ℃防置40分鐘。Pbs洗4次，吸干水分，不拍板，觀察。

7.顯微鏡亮度：1.5亮度

注意：1.做不接毒的空白細(xì)胞對(duì)照。

         2.pbs洗要同一位點(diǎn)加入，要溫柔。

         3.鋪板同步接毒。

②膠體金初步鑒定

 18G4標(biāo)記金，10A2 劃線組合，測(cè)定病毒液1:5稀釋，*。

所開發(fā)試紙條產(chǎn)品顯示： 1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測(cè)各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，可以將油佐劑疫苗冷凍破乳化，但不可以用乙醇和二甲基亞砜等使蛋白變性的有機(jī)溶劑破乳化。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測(cè)豬瘟病毒。

配對(duì)情況：10A2-18G4    ，推薦10A2劃線，18G4標(biāo)記金。

推薦使用濃度： 膠體金： 5微克/ml金液，劃線0.5-1mg/ml

                ELISA： 1：50 000-50 0000

                WB及免疫組化，免疫熒光：1:50-1：500

③ 特異性、符合率、穩(wěn)定性、靈敏度、假陽性率、假陰性率

特異性： 本配對(duì)抗體開發(fā)的試紙條產(chǎn)品只識(shí)別豬瘟病毒,與其他病毒無交叉反應(yīng)。

符合率：本試紙條與PCR符合率99%。

穩(wěn)定性:  本試紙條常溫的保質(zhì)期為36個(gè)月。

靈敏度： 不低于PCR的靈敏度。

假陽性率： <5%

假陰性率:   0%

四、配套羊抗鼠二抗與萬能C線反應(yīng)蛋白； CSFV純化標(biāo)準(zhǔn)陽性 抗原。

五、產(chǎn)品說明書附錄

生產(chǎn)公司：山東綠都生物科技有限公司

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