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實驗儀器PCR儀常見問題和解決方案

閱讀:2069發(fā)布時間:2015-1-21

     PCR儀已經(jīng)成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達(dá)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種儀器。PCR儀在操作中常會遇到哪些問題呢?該如何解決呢?
   1、PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤,這大多是由于聚合酶忠實性低或者循環(huán)數(shù)太多,這時需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶,同時降低循環(huán)數(shù)。此外,四種dNTP的濃度不同也會出現(xiàn)該問題,此時應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。
  2、PCR跑膠,目的條帶很亮,但是邊沿不清楚,前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題,則需要進(jìn)行細(xì)致的分析,因為引起該問題的可能很多??上葯z查是否模板質(zhì)量問題,如有降解等,模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時有污染,則需要重新抽提RNA。此外,也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問題,可提高退火溫度,少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時間太長,ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換,電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起,則進(jìn)一步檢查加樣量是否過大,制膠過程中膠孔是否制好,EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對具體原因再采取相應(yīng)的措施。
  3、PCR產(chǎn)物何時需要用凝膠純化,何時不需要?當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時,則不需要使用凝膠純化。當(dāng)可見其他雜帶時,則可能是積累了大量引物的二聚體,在克隆前需要做凝膠純化。
  4、如果實驗中沒有回收到目的片段,則需要繼續(xù)進(jìn)行對照實驗。包括涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,計算菌落生長數(shù),測定轉(zhuǎn)化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體,連接pGEM-T正對照,轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞,按照的實驗步驟進(jìn)行。
  5、實驗中出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增該怎么辦?這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染的表現(xiàn),應(yīng)通過檢查排除污染源。首先考慮是否為試劑污染,可將試劑分裝好直接置于PCR儀中擴(kuò)增進(jìn)行判斷。其次要考慮是否為實驗室污染,可更換所用的移液器、吸咀管(離心管)等,將試驗中的關(guān)鍵步驟轉(zhuǎn)移到一個新的環(huán)境中,判斷是否為實驗室污染。如果是則需要對整個實驗室及實驗器材*清洗處理,保持良好的通風(fēng)、清潔等。此外,還要考慮是否為采樣污染,一般表現(xiàn)為一批結(jié)果陽性率很高,一批結(jié)果陽性率又下降很多,如此反復(fù)。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣。
  6、實驗中出現(xiàn)假陰性擴(kuò)增該怎么辦?首先要考慮是否為儀器故障,儀器應(yīng)正常運(yùn)轉(zhuǎn),尤其要注意加熱溫度及各管間的差異是否符合實驗要求,是否出現(xiàn)誤差等。其次要考慮是否為試劑失效或無效引起,使用有效的試劑。

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